茶堿聯合紅霉素對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥介質及HDAC-2的影響

高少勇，金詠絮，連寧芳，林其昌，陳公平

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全可逆及持續進展的氣流受限為特征的全身慢性炎癥性疾病，糖皮質激素在治療該疾病中的應用一直是臨床關注的熱點[1]。研究發現，COPD患者存在糖皮質激素抵抗現象，原因可能與組蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2，HDAC-2)的表達下降有關[2-3]。已有文獻報道，在COPD患者中，小劑量茶堿能減輕炎癥反應，紅霉素具有抗炎作用[4]。本研究以SD大鼠為基礎構建COPD大鼠模型，探討茶堿聯合紅霉素治療COPD的效果以及對HDAC-2表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級雄性SD大鼠[上海斯萊克實驗動物有限責任公司(許可證號：HLK0305)]50只，體質量(270±15)g(250～350 g)，適應性飼養1周。

1.1.2主要試劑 紅霉素(國藥準字H42021990，宜昌人福藥業有限責任公司)；茶堿緩釋片(國藥準字H44023791，廣州邁特興華制藥廠有限公司)；DAB顯色試劑盒、通用型SP免疫組織化學試劑盒(上海銘博生物科技有限公司)；兔抗大鼠HDAC-2多克隆抗體(美國BioVision公司)；白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒(上海康朗生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純國產試劑。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設備有限公司)；臺式低溫高速冷凍離心機(太倉市醫療械廠)；紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)；全自動生化分析儀(iChem-530，深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)；電泳儀(上海第三分析儀器廠)；電子天平(BS223S型，北京賽多利斯儀器系列有限公司)；石蠟切片機(上海仙申醫教儀器廠)。

1.2方法

1.2.1動物分組 取雄性SD大鼠50只，隨機分為正常組(n=10)和COPD組(n=40)，COPD組再采用隨機數字表法分為4組，對照組、紅霉素組、茶堿組及紅霉素+茶堿組，每組各10只。

1.2.2構建COPD大鼠動物模型 取40只大鼠，于第1天和第14天腹腔內注射10%的水合氯醛(3 mg/kg)麻醉大鼠，經口氣管插管后滴入0.2 mL(1 g/L)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。第2～13天和第15～30天，放入自制玻璃熏煙箱中被動吸煙，1支/只，持續約0.5 h，每日2次，2次至少間隔6 h。具體方法：將點燃的香煙煙霧通過自制三通管抽吸到50 mL注射器中，關閉吸煙通路一端，打開注射器與熏煙箱連接的通路端，將煙霧注入熏煙箱，使大鼠被動吸煙。香煙(紅七匹狼)焦油含量12 mg，煙堿量1.1 mg。正常組(n=10)給予0.2 mL生理鹽水和新鮮空氣處理。

1.2.3給藥方法 第31天，將COPD大鼠隨機分為對照組、紅霉素組、茶堿組、紅霉素+茶堿組，每組10只。對照組予生理鹽水灌胃，每日1次，每次2 mL；紅霉素組予紅霉素(配置成1.25%的紅霉素口服液，現配現用)灌胃(100 mg/kg)，每日1次；茶堿組予氨茶堿灌胃(80 mg/kg)，每日1次；紅霉素+茶堿組將上述濃度的紅霉素及氨茶堿灌胃。各組給藥時間均為30 d。

1.2.4標本取材 第61天，將各組大鼠麻醉，以5 mL一次性注射器行心臟穿刺取血，留取5 mL全血，靜置20 min，3 000 r/min離心15 min，將血清分裝于2 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱中待測。結扎右主支氣管，于隆突上用套管針穿刺至左肺，以2 mL生理鹽水灌洗左肺，再緩慢回抽，每次回收液體約1.5 mL，如此反復灌洗3次，回收率約75%，再次離心，取上清液放置于-80 ℃冰箱中。留取一側肺葉，置于50倍體積的4%多聚甲醛中固定6 h，石蠟包埋、切片，準備進行H-E染色和免疫組織化學染色。

1.2.5檢測方法 按照說明書步驟進行酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清及肺泡灌洗液中的IL-8及TNF-α水平，并將大鼠的肺組織進行H-E染色，采用免疫組織化學技術檢測肺組織中HDAC-2表達，采用圖像分析系統測定大鼠肺組織中的HDAC-2的陽性系數。每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，以胞質或胞核內出現黃色或棕黃色顆粒者為陽性細胞，采用圖像分析系統采集圖像，檢測每個高倍鏡視野下陽性細胞的平均吸光度值，取平均值作為陽性表達的相對強度，對比各組指標間的差異。

2 結 果

2.1血清及肺泡液IL-8及TNF-α水平 與正常組比較，對照組大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均顯著上升(P<0.05)；經紅霉素和茶堿分別處理后，大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均顯著下降(P<0.05)；紅霉素+茶堿組大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均顯著低于紅霉素組和茶堿組(P<0.05)，具體見表1。

表1 各組大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平比較Tab 1 Comparison of serum and alveolar fluid IL-8 and TNF-α levels in each group ng/L

n=10.IL-8:白細胞介素8；TNF-α：腫瘤壞死因子α.與對照組比較，△：P<0.05；與紅霉素組比較，▲：P<0.05；與茶堿組比較，★：P<0.05.

2.2組織學表現特點 正常組大鼠的肺泡及氣管上皮結構完整，無肺泡破裂、融合，肺間質無炎性細胞浸潤、水腫，肺泡間隔無增厚。對照組大鼠的肺間質可見大量炎癥細胞浸潤、水腫，肺泡間隔增厚，部分肺泡破裂、融合形成肺大泡。與對照組比較，紅霉素組和茶堿組支氣管黏膜的增厚程度、炎癥細胞浸潤明顯減輕。紅霉素+茶堿組平滑肌細胞、基底細胞排列相對規則，炎癥細胞浸潤程度較輕，與正常組大鼠的支氣管肺組織差別不大(圖1)。

2.3HDAC-2表達情況 與正常組(92.53±9.32)比較，對照組大鼠肺組織的HDAC-2表達水平(17.56±1.35)顯著降低(P<0.05)；與對照組比較，紅霉素組和茶堿組大鼠肺組織的HDAC-2表達水平(33.56±2.85)，(39.65±3.15)均顯著上升(P<0.05)；紅霉素+茶堿組大鼠肺組織的HDAC-2表達水平(68.75±5.31)均顯著高于紅霉素組和茶堿組(P<0.05，圖2)。

A：正常組，肺泡及氣管上皮結構完整，無肺泡破裂、融合；B：對照組，肺泡間隔增厚，部分肺泡破裂、融合形成肺大泡；C：紅霉素組，肺間質炎癥細胞浸潤減輕；D：茶堿組，肺間質炎癥細胞浸潤明顯減輕；E：紅霉素+茶堿組，基底細胞排列相對規則，肺泡破壞程度減輕.圖1 各組大鼠肺組織組織學表現特點(H-E ×100)Fig 1 H-E staining results of lung tissue of each group of rats (H-E ×100)

HDAC-2：組蛋白去乙酰化酶2.A：正常組，HDAC-2高表達；B：對照組，HDAC-2低表達；C～E：分別為紅霉素組、茶堿組及紅霉素+茶堿組，均表現為HDAC-2表達上升.圖2 各組大鼠肺組織HDAC-2免疫組織化學檢測結果(×400)Fig 2 HDAC-2 immunohistochemistry results of lung tissue of each group(×400)

3 討 論

COPD是一種以氣流阻塞為臨床特征的慢性氣道炎癥性疾病，其主要發病因素是吸煙，相關數據顯示，90%以上的COPD與吸煙相關[5]，因此，被動吸煙是構建COPD動物模型的經典方法。目前，已有學者采用氣道內2次滴入脂多糖聯合被動吸煙的方法構建大鼠COPD模型[6]。本研究參照該方法進行，結果顯示，對照組大鼠肺組織病理發生明顯改變，與人類COPD的病理改變一致，表明COPD大鼠模型構建成功。

目前認為，慢性炎癥在COPD的發生發展過程中具有重要作用，多種炎性細胞和細胞因子參與肺組織和氣道結構的損傷和重構過程，導致氣流受限，發生不完全可逆的進展[7]。IL-8是中性粒細胞趨化因子，而TNF-α是一種強效的促炎癥因子，二者均可以促進細胞因子及炎性介質的釋放，被證實參與了COPD的發生與發展過程，在COPD的發病過程中發揮重要作用[8-10]。本研究結果顯示，在COPD的發病過程中，IL-8和TNF-α表現為較高表達。

研究證實，紅霉素長期用于治療COPD，可顯著降低COPD患者急性加重次數及痰液中炎癥因子IL-8水平[11]。茶堿類藥物具有提高氣道平滑肌細胞內環磷酸腺苷濃度、從而抑制磷酸二酯酶的作用，在治療COPD中效果明顯，可通過抑制腺苷受體拮抗腺苷而抑制核因子(NF)-κB的轉錄，最終降低炎癥因子的水平[12]。本研究中，單獨應用紅霉素或茶堿后，COPD大鼠血清及肺泡液中的IL-8和TNF-α水平明顯降低，聯合應用紅霉素和茶堿后進一步降低。表明二者聯合應用治療效果更佳，可有效減輕炎癥反應，這與臨床的試驗結果一致[13]。

目前，糖皮質激素是治療COPD最主要的藥物，也是最有效的抗炎藥物之一。臨床研究證實，小劑量糖皮質激素可幫助減輕氣道炎癥，緩解哮喘患者的癥狀，但糖皮質激素對多數COPD患者的治療效果并不理想，易發生糖皮質激素抵抗[14]。糖皮質激素抵抗的機制目前尚不明確，可能的機制包括絲裂原活化蛋白激酶通路被細胞因子激活、巨噬細胞遷移抑制因子增加、轉錄因子激活通路缺乏、P-糖蛋白介導的藥物外排增加、HDAC-2的表達降低等[15]。研究表明，COPD患者中HDAC-2的表達及活性降低與糖皮質激素抵抗密切相關，其對激活的炎性基因去乙酰化作用降低，導致無法阻斷炎性基因的轉錄，從而減弱糖皮質激素的抗炎作用，可能是該類患者發生糖皮質激素抵抗的重要途徑[16]。當發生糖皮質激素抵抗時，尋求有效的改善方法在臨床應用中是十分必要的。研究顯示，紅霉素可通過上調HDAC-2蛋白的表達減輕氧化應激下THP-1細胞的糖皮質激素抵抗[17]。氨茶堿能夠改善COPD大鼠的肺功能，肺組織的HDAC活性和HDAC-2蛋白表達增高，而肺組織中IL-8水平降低[18]。然而，該研究也發現，氨茶堿并不能在轉錄水平上影響HDAC-2，但卻可以增加其蛋白的表達，具體分子學機制尚不明確。本研究結果表明，紅霉素或茶堿均有助于改善COPD大鼠的炎癥反應，聯合應用效果更好，可以上調HDAC-2表達，推測聯合應用2種藥物可能可以改善COPD大鼠糖皮質激素抵抗。

綜上所述，紅霉素和茶堿均可有效減輕COPD大鼠的炎癥反應，并上調肺組織的HDAC-2表達水平，且二者聯合應用效果更好，但具體的分子機制有待進一步研究。