高架十字迷宮在焦慮大鼠模型判定中的應用

羅丹妮(綜述)，李 瑛，周思遠(審校)

隨著工作、生活節奏加快，壓力增大，焦慮是臨床常見癥狀，過度焦慮可導致焦慮癥、抑郁癥等心理疾病，嚴重影響人們的生活質量和健康水平。焦慮狀態動物模型的制作對進一步研究疾病十分重要。高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)實驗是利用動物對新異環境的探究特性和對高懸敞開環境的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態，是動物焦慮行為學研究中較為經典的測試。但目前對于EPM實驗的應用并無統一標準。筆者通過檢索以往應用這項實驗評價大鼠焦慮狀態的研究，并進行整理分析，以期為后續使用該方法評價焦慮大鼠模型提供參考。

1 EPM實驗方法

在中國知網全文數據庫、萬方數據庫、維普期刊全文數據庫、pubmed全文數據庫以“高架十字迷宮”、“焦慮”、“大鼠模型”、“elevated plus maze”、“anxiety”、“rat models”為主題詞對2012—2017年的文獻進行檢索，排除其中因藥物副作用導致焦慮、高脂飲食喂養導致肥胖伴發焦慮、重復發表及未用具體數字表明EPM實驗結果的文獻，最后篩選出文獻47篇，闡述如下：

1.1EPM的設置 現有文獻中，常用的EPM多在溫度、濕度相對穩定、進行過遮光處理、安靜的房間里設置4個高于地面的十字交叉窄臂。十字臂距離地面的高度通常為40～70 cm[1-3]，其中50 cm的較多[4-5]，一般不超過75 cm[6-7]。2 條開放臂的尺寸多為45 cm以上的長度、寬度為10 cm或15 cm，邊為1 cm的臂高[1-8]。另外兩條多為長寬與開放臂相同的封閉臂，其臂高多為30 cm或40 cm以上[8-12]，僅發現一項研究中封閉臂的臂高為12 cm[3]。4條臂之間的中央連接區多為15 cm×15 cm或10 cm×10 cm的正方形[1-12](圖1)。

A：十字臂距離地面的高度；B：開放臂長度；C：開放臂寬度;D：開放臂臂高；E：封閉臂臂高；F：中央連接區．圖1 高架十字迷宮示意圖Fig 1 The schematic of elevated plus maze

1.2將大鼠放置入EPM的初始狀態 EPM實驗開始時多將單只實驗大鼠置于迷宮中央平臺區，大鼠頭朝向其中一個開放臂或封閉臂[13-16]，也有研究開始時將大鼠放置于其中一個開放臂，頭朝中央區域[17-18]。

1.3大鼠提前進入實驗環境時間 一般提前15 min 將大鼠放入EPM實驗房間，使其適應環境[19]，也有實驗提前1 h[15]或2 h[20]。

1.4實驗時長 大多數文獻中每只大鼠在EPM實驗時間為5 min[1-7]，少數研究將時間延長到10 min，甚至更長時間[9,18]。

2 EPM實驗結果評判方法

EPM實驗過程中，多由操作者人工或通過迷宮上設置的攝像、跟蹤設備記錄大鼠進入開放臂次數(open arm entry,OE)、開放臂停留時間(open arm time,OT)、進入封閉臂次數(closed arm entry,CE)及封閉臂停留時間(closed arm time,CT)，并計算進入開放臂次數百分比[OE%=OE/(OE+CE)×100%]以及在開放臂停留時間百分比[OT%=OT/(OT+CT)×100%]。OE及OT減少反映大鼠焦慮情緒加重。也有研究在此基礎上增加了各臂的總出入次數這一評判指標，以幫助判斷受試大鼠的活動水平。各臂總出入次數減少表明大鼠活動水平降低，在排除其他因素后，可推測大鼠的焦慮情緒加重[21]。

3 EPM實驗結果

3.1焦慮模型大鼠造模成功實驗結果 在大多數使用慢性應激方法制造焦慮模型大鼠的研究中，造模結束后多將焦慮造模后的大鼠與未進行造模的空白大鼠同時進行EPM實驗檢測，通過焦慮模型組大鼠在EPM中的表現與同期空白組對比分析，判定是否造模成功。部分文獻記錄造模后大鼠的OT，并與空白組的OT進行統計學比較，若模型組大鼠相較于空白組大鼠的OT低(P<0.05)，認為造模成功(圖2A)[2,4,13,16-17,22-29]；同理，模型組的OE低于同期空白組(P<0.05)也可判定造模成功[2,4,17,23,25,29-36]。大多數研究的模型組大鼠的OE都<4次(圖2B)，其中僅1項研究模型組大鼠的OE>4次，可能因造模方式較為單一，焦慮程度不及其他組嚴重[2]。還有部分文獻選用模型組大鼠的OT %與空白組大鼠的OT%比較，較低(P<0.05)則表示模型組大鼠焦慮情緒更重，判定造模成功[5,7,13-14,16-19,23,25-28,35,37-51]。大多數模型組的OT%低于20%，其中2項研究中模型組的OT%>20%(圖2C)。鄭源等的研究可能是因為采用了空瓶應激的單一造模方式，導致模型組大鼠焦慮程度較輕，但與空白組大鼠比較，仍有統計學意義[40-41]。空白組的OT%多在20%～40%，但也有6項研究中空白組OT%<20%，這6項研究中，2組的OT%均偏小，其中1項研究中模型組的OT%僅為2.18%[48]。同樣，模型組大鼠的OE%低于空白組(P<0.05)也表示造模成功[13,19,22-23,39,44-45,48-49,52-56]。模型組型大鼠的OE%多在25%以下，其中有3項研究的模型組的OE%>25%，但相對來說，2組的OE%都偏大(圖2D)。

OT：開放臂停留時間；OE：進入開放臂次數；OT%：開放臂停留時間百分比；OE%：進入開放臂次數百分比.A：OT值比較；B：OE值比較；C：OT%比較；D：OE%比較.圖2 各項研究造模后模型組與空白組實驗結果比較Fig 2 Comparison of experimental results between model group and blank group after modeling

3.2焦慮模型大鼠造模失敗實驗結果 在Oliveira用80 d束縛造模的研究中，空白組與模型組的OT比較，差別無統計學意義，且模型組的OT值(10.4±34.7)s高于空白組的OT值(9.72±33.3)s，但2組的標準差均偏大，可能由于組內差別過大造成[57]。在Dubey的研究中，可能由于封閉臂的臂高過矮(12 cm)造成焦慮造模組的大鼠的OT為(62±4.66)s，甚至大于空白對照組(48.5±4.61)s[3]。而其他陰性(P>0.05)結果中，無論結局指標選用了OT%還是OT絕對值，焦慮造模組的結果均略低于空白對照組。

4 討 論

EPM實驗基于大鼠對于開放、無保護以及高懸環境的恐懼、對新事物的好奇以及天生對黑暗環境的傾向，形成“探究-規避”行為沖突，模仿人類的焦慮狀態[58]。測試過程中若大鼠對開放環境的探究減少則表明焦慮情緒增加，是經典的動物焦慮行為測試儀器。但在操作過程中，由于設備以及操作細節的差別造成實驗結果未能有客觀統一標準，多靠造模前后比較或與空白組數據比較以判斷造模后的大鼠是否存在焦慮情緒。

十字迷宮距離地面較高，相當于人站在峭壁上，使實驗大鼠產生恐懼和不安心理。其中EPM中的封閉臂因有一定的遮擋，形成在高懸環境中的相對保護，并對光線起一定遮蔽效果，滿足大鼠的嗜暗性傾向；開放臂則造成了大鼠對高懸敞開明亮環境的懼怕與探究天性的矛盾。在EPM實驗中，焦慮狀態越嚴重的大鼠，對高懸敞開環境的懼怕愈盛，探究性行為愈少。EPM中十字交叉窄臂的寬度會決定開放臂的敞開環境以及封閉臂的安全感，影響這兩者的差別程度，同時也會決定中央連接區的面積，間接影響大鼠在中央連接區的等待時間。開放臂與封閉臂的差別在于封閉臂的臂高，結合大鼠的自身高度考慮，臂高需要達到一定的高度才能形成封閉環境，給予大鼠安全感，誘導大鼠的探究行為以完成實驗。

將大鼠放置進入EPM的初始位置為中央連接區，頭朝封閉臂則開始實驗時就使其傾向躲避，進入保護環境，但這一操作可能會使實驗大鼠在實驗全程錯過開放臂。而在初始時大鼠面向開放臂，使高懸敞開環境對大鼠起到一定的新奇刺激，讓其陷入探究與回避的矛盾，更有利于通過進入開放臂的時間及次數客觀評價其焦慮程度。若初始狀態時就將大鼠放置于開放臂，則高懸敞開環境可能放大大鼠的懼怕，進而造成實驗結果失真。在進行實驗之前，大鼠應當提前進入實驗的房間，適應其溫度、濕度以及光線等環境情況，避免大鼠突然進入新的實驗環境造成的不適影響實驗結果。在EPM實驗中，如果實驗時間過短，未等實驗大鼠適應環境就提取數據，可能造成實驗結果不真實；而實驗時間過長，可能導致大鼠對開放環境的新奇度降低，也可能由于拉長整個實驗的觀察時長，導致大鼠因生活節律影響造成差別。

在EPM實驗結果報道方式方面，大多數研究都選用了實驗大鼠的OT和OE，或者與其具有相關性的OT%和OE%。OT直觀體現大鼠對高懸敞開環境的恐懼程度，OT越小，反映大鼠的恐懼心理更重；OE則體現大鼠對新奇刺激的探究性，進入次數越多體現大鼠的焦慮越輕。OT%計算了OT在開放臂和封閉臂時間總和中的所占比，計算過程考慮了在封閉臂的停留時間而更客觀反映大鼠對高懸敞開環境的恐懼；而OE%將比對進入開放臂及封閉臂的次數，反映出大鼠“探究-規避”的偏好。

由以上文獻歸納看，在應用EPM實驗評判時選用OT或OE值呈現結果的文章數量較少，雖造模成功的文獻中模型組大鼠的OE<4次，但由于樣本量的局限，較難給出可信的參考值范圍；焦慮造模成功大鼠的OT值也并沒有呈現明顯規律。采用OT%或OE%作為判定結果的表示方式的文獻稍多，空白組大鼠的OT%多為20%～40%，OE%多在30%以上；造模成功的焦慮模型大鼠的OT%多在20%以下，OE%多在25%以下。

綜上所述，建議應用EPM的操作方法為：選用適當的EPM設備，臂寬為10 cm，封閉臂的臂高>30 cm(高于大鼠站立時視野)，實驗操作前先將大鼠提前放入實驗環境1 h以上，實驗開始時將大鼠放置于中央區域，使其頭面向其中一個開放臂，單只大鼠實驗進行5 min，實驗結果若選用OT%，OE%，則可參考OT%<20%和OE%<25%為焦慮模型成功。