微球法觀察急性低氧應激對小鼠臟器血流量的影響※

袁周陽，張 昱，馬倩倩，周義玲，汪曉洲，紀巧榮，曹成珠，劉 杰，穆罕默德·杰馬，張 偉，2，3*

(1.青海大學醫學院；2.青海大學高原醫學研究中心；3.青海省高原醫學應用基礎重點實驗室，西寧 810001)

無論是急進高原的人群還是航空、航天作業中突發急性缺氧的人群，急性低氧應激的代償都對機體適應突變的外界環境起著非常重要的調節作用，主要影響心血管系統及呼吸系統。目前低氧應激早期循環系統血流分布情況不明，其對深入研究高原病的發生發展和航空、航天醫學研究造成了障礙。本研究主要通過給予小鼠急性低氧通氣模擬急性低氧應激刺激，采用彩色微球技術來觀察刺激狀態下小鼠主要臟器的血流分布情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗選用BALB/c雄鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號為：SCXK(京)2016-0006號]，分對照組和低氧組，每組8只，體重26±2 g。小鼠均置于24 ℃、晝夜交替、自由飲食飲水條件下飼養。

1.2 實驗藥品和試劑選擇

彩色微球(黃色，紅色，藍色)DYE-TRAK購于Triton Technology 公司；Tween80和Triton X-100購于Solarbio公司，硫柳汞購于上海中秦化學試劑有限公司，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)購于Aladdin公司，無水乙醇購于天津市富宇精細化工有限公司，戊巴比妥鈉購于上海泰瑞爾生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器選擇

Power Lab生物信號采集系統、壓力傳感器購于AD Instruments公司，呼吸機(950 North Hague Avenue Columbus，Ohio 43204-2121 U.S.A)購于Columbus Instruments公司，酶標儀(infinite M200 PRO)購于TECAN公司，手持式血液分析儀(300-G)購于雅培貿易上海有限公司。

1.4 實驗動物手術

小鼠于術前12 h禁食，用1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉后固定于小鼠體溫維持操作板，做小鼠氣管插管及右頸總動脈插管，將聚乙烯導管(ID 0.3mm，OD 0.5mm)經右頸總動脈置入左心室。通過Power Lab生物信號采集系統監測小鼠左心室壓，判定導管已到達心室腔。將小鼠氣管插管連接呼吸機，設置潮氣量為6.5 mL/kg。對照組小鼠通入室內空氣(西寧地區，大氣壓582mmHg，PO2121.6mmHg)，低氧組通入15%氧氣濃度的混合氣體(15% O2，85% N2)。兩組于通氣1、3 min末通過左心室插管向心室勻速注入黃色、紅色微球制備液100 μL(微球數約60000個)后，立即用適量肝素生理鹽水沖管，待微球穩定5 min，腹腔注射過量麻醉藥品處死小鼠。

1.5 臟器組織處理

取小鼠心、腦、肺、肝臟和腎臟組織，用半干濾紙吸凈臟器組織上的多余血液，置于15 mL離心管稱量。組織處理方法參照Hakkinen[1]和粱斌[2]等的方法。首先向各組織樣本中加入100 μL含5 000個藍色微球的微球質控液，作為回收率測定的質控物。向各個離心管中加入12 mL濃度為1 mol/L的KOH溶液，混勻后放置于60 ℃水浴鍋過夜(12h)。期間需開蓋釋壓、渦旋，待組織器官完全消化溶解后，離心(1500g)15 min后用吸管抽棄上清液至距管底1 cm高度，勿擾動管底微球。加入50 ℃蒸餾水12 mL，混勻后離心(1500g)5 min，棄上清液至管底1 cm處。再加入10% TritonX-100試劑12 mL，離心(1500g)5 min后棄上清液(腦組織處理需使用15% TritonX-100試劑12mL，重復兩次)。最后每管先后加入酸化乙醇和無水乙醇12 mL，離心(1500g)5 min后棄上清液，打開離心管蓋存放在避光處，至無水乙醇于室溫下完全蒸發。單獨制備6個藍色微球的100%回收標準管，每管加入相應含5 000個藍色微球的質控液100 μL，加入無水乙醇6 mL，離心(1500g)5 min后抽棄上清液，避光開蓋待干燥后測其標準管藍色微球吸光度值，作為標準管的OD值。

向已干燥的離心管中加入DMF試劑150 μL，靜置15 min后渦旋15 min，待微球染料充分被萃取。離心(1500g)5 min后小心取出離心管。用移液槍吸取100 μL提取液到96孔板中。設置波長：黃光448 nm、紅光535 nm、藍光672 nm。分別檢測組織樣本提取液在不同最大吸收波長處的吸光度值，根據公式計算組織臟器相對血流量。

1.6 動脈血氣分析

另取小鼠建立氣管插管通道，采用右側頸總動脈插管法在低氧通氣前、低氧通氣1 min、低氧通氣3 min時取動脈血約90 μL行動脈血氣分析。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 微球回收率情況

圖1顯示，標準管和各組織樣本回收微球吸光度情況，藍色微球標準管(STDS)平均吸光度值為0.2330(標準差0.007)AU(作為100%回收率)。實驗所測得組織樣本微球回收率在84.86%到92.05%之間，符合實驗要求。

圖1 各組織臟器藍色質控微球染料回收吸光度結果圖Figure 1 Mean absorbance of dye extracted from blue microspheres isolated from tissues of mice

2.2 小鼠器官相對組織血流量結果

表1顯示，通氣3 min和1 min時相比，各個器官組織血流量有所降低(除低氧組肺營養血管血流量外)，但與對照組相比，低氧1 min和3 min的相對血流量趨勢大致相同。

血流測量結果顯示，急性低氧應激時腦血流量明顯增加(P<0.05)、心肌組織血流量有所升高但無顯著差異(P>0.05)、肺營養血管血流量有所升高但無顯著差異(P>0.05)、肝組織血流量明顯降低(P<0.05)、腎組織血流量升高(P<0.05)。

表1 小鼠器官相對血流量結果Table 1 The resul to frelative blood flow in

續表：

2.3 通氣1 min到3 min小鼠器官組織血流量降低結果

表2顯示，通氣3 min和1 min時相比，在腦血流降低量(0.0130±0.0066，0.0138±0.0038，P>0.05)、心肌血流降低量(0.0458±0.0822，0.0456±0.0400，P>0.05)、肝臟血流降低量(0.0031±0.0025，0.0020±0.0011，P>0.05)以及腎血流降低量(0.0914±0.0552，0.0894±0.0450，P>0.05)上，對照組和低氧組均無顯著差異，肺營養血管血流降低量(0.0073±0.0052，0.0006±0.0025，P<0.05)在低氧組明顯低于對照組。

表2 通氣1min到3min小鼠器官組織血流降低情況Table 2 The changes of blood flow from 1 min to 3min

2.4 常氧通氣、低氧通氣1 min、低氧通氣3 min時的動脈血氣分析結果

表3顯示，常氧與低氧通氣1、3 min時采集動脈血行血氣分析對比，結果顯示與常氧時比較，低氧通氣1、3 min時小鼠動脈血pH值無明顯差異，動脈血氧分壓(Arterial partial pressure ofoxygen，PaO2)和血氧飽和度(Arterial Oxygen Saturation，SaO2)均降低(P<0.05)；低氧通氣1 min與3 min時比較，血氣分析結果無統計學差異。

表3 常氧通氣、低氧通氣1 min、低氧通氣3 min時動脈血氣分析結果Table 3 The results of arterial blood gas under normoxia and hypoxia 1 min and 3

* ：P<0.05，與Normoxia比較；#：P<0.05，與Hypoxia 1 min比較

3 討論

應激(stress)作為重要的非特異性防御反應，是機體在受到內外環境的刺激時出現的一種各系統調節動員的反應[3]。發生應激反應時，下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統(hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system，HPA)和交感-腎上腺髓質系統(sympathetic cadrenal medulla system)被激活，對機體有重要的調節作用[4]。本研究采用在海拔2 260米、大氣壓582 mmHg、氧分壓87.3 mmHg下的西寧地區向實驗小鼠通入15% O2和85% N2的混合氣體(相當于海平面11%的O2含量)開展相關實驗，其中氧氣濃度是課題組前期研究的有效低氧應激氧氣濃度[5]。對照組及低氧組均采用氣管插管連接呼吸機通氣，保證通氣的頻率及深度，排除了由于缺氧引起過度通氣導致CO2分壓改變對血流量的影響[6]。實驗通過呼吸機給小鼠通入室內空氣和低氧氣體并選取頸外動脈采集動脈血[7]行血氣分析結果對比，達到了研究急性低氧應激小鼠實驗目的。

測量血流量的方法很多，常用的方法有超聲多普勒測血流法、激光多普勒血流檢測法、二氧化碳費克法、彩色微球測血流法等[8，9]。本實驗采用彩色微球法可以測量多個組織臟器在同一時刻的血流量。彩色微球是一種直徑為15 μm的聚苯乙烯小球，從實驗動物左心室注入微球混懸液，微球隨體循環血液被運送至各個組織臟器并嵌頓于其毛細血管中，通過臟器組織處理，回收微球并萃取其表面染料，再通過紫外分光光度計或酶標儀來檢測微球染料在不同最大吸收波長處的OD值，根據公式計算組織臟器相對血流量，所測OD值與實驗動物臟器相對血流量呈正比關系。彩色微球法不僅可一次性測量同一時刻多個臟器的血流量，還可序貫測定同一實驗動物經歷多種條件時的臟器血流變化，且彩色微球與放射微球相比具有無輻射、易儲存等特點，是國內外廣泛認可的一種測血流量的經典方法[10]。

研究發現，急性低氧通氣時，腦、腎血流顯著升高，心肌血流量有所升高，肝血流量明顯下降。在注入微球1 min至3 min血流量變化結果中，3 min血流量較1 min普遍降低，但各組變化趨勢大致相同。我們推測是由于1 min時注入的微球在臟器組織造成了一定程度的嵌頓，導致3 min血流量整體下降；但低氧應激時的肺營養血管血流在1 min至3 min時降低不明顯，與對照組相比，1 min至3 min的血流降低量明顯小于對照組，提示低氧應激時肺營養血管的血流量反而增加。

由于實驗通過呼吸機給予實驗動物低氧通氣，因此可排除低氧通氣反應、低碳酸血癥血管收縮反應等因素造成的血流變化，低氧血管舒張反應可能是引起腦、腎血流升高的原因。有研究表明低氧能擴張人類大腦中動脈、頸動脈以及椎動脈[11]。缺氧時，腦血流的補償性增加足以維持腦氧輸送。低氧對腦血流影響的潛在機制較復雜，涉及諸多生理學因素，存在代謝和生化過程的相互作用。腦血管擴張的機制可能會和低氧暴露程度、持續時間，大腦對O2、CO2和pH變化的反應性以及局部釋放血管活性因子的程度有關[12，13]。有關腎臟在急性低氧時血流量的變化研究較少，主要為新生兒窒息與腎血流相關性的研究，結果表明窒息缺氧時新生兒腎血流灌注阻力增大、流速減慢導致腎血流灌注減少[14]。因其選用的研究對象為出生大于24 h的窒息兒，與本研究選用的急性低氧通氣3 min小鼠無論從研究對象還是缺氧情況都具有巨大差異。非神經系統器官肝臟在低氧應激時血流量下降，可能與肝血管中分布的介導血管收縮受體及受體密度不同導致低氧應激時肝臟血流降低有關。肺組織所測血流量為微球嵌頓在肺營養血管中所測得血流情況，各臟器組織3 min較1 min血流量均降低但低氧應激時的肺營養血管血流1 min到3 min無明顯變化，推測低氧應激可調節肺營養血管使血流增加，保證在急性低氧應激時肺組織的血氧供給量[5，15]。

綜上所述，急性低氧應激作為一種外界刺激因素能夠影響小鼠臟器組織血流分布，使腦、腎和肺營養血管血流升高，肝血流降低。這種變化可能與低氧應激時組織臟器血流重新分布，優先供應重要臟器有關。