基于環介導等溫核酸擴增技術分型檢測多房/細粒棘球蚴方法的建立※

蔣巧燕，張 穎，胡繽文，湯 鋒#，李潤樂&

(1.青海大學高原醫學研究中心，青海省高原醫學應用基礎重點實驗室，高原醫學教育部重點實驗室，青海 西寧 810001；2.青海大學醫學院，青海 西寧 810001)

棘球蚴病分為泡型包蟲病(alveolar echinococcosis，AE)、囊型包蟲病(cystic echinococcosis，CE)，分別由多房棘球蚴(E.m.)、細粒棘球蚴(E.g.)感染引起[1]，由于形態學觀察很難區分絳蟲屬蟲卵，目前疾控無法準確區分不同環境中的棘球絳蟲污染源[2]，因此需建立起一種對多房/細粒棘球蚴分型的快速檢測方法。2000年，Notomi[3]等創建了一種在等溫條件下進行核酸擴增的新技術，即環介導等溫核酸擴增技術(LAMP)，由于該技術具有快速、精確、高敏感性及等溫擴增和無需專門儀器設備等優點，近年來，被廣泛應用于病原微生物的快速檢測。

線粒體DNA具有母系遺傳、缺乏重組和進化速率高等特點，是研究物種進化與區分物種的一個很有用的遺傳標記[4]，NADH脫氫酶第二亞基(ND2)作為線粒體電子傳遞鏈復合體的關鍵組分與線粒體其他蛋白質編碼基因和rRNA相比具有更快的進化速率[5]，許多學者已經將ND2基因序列應用于生物分子系統學的研究[6]。本實驗利用生物信息學軟件Primerexplorer，針對多房/細粒棘球蚴線粒體基因組ND2基因，設計出可用于區分多房和細粒棘球蚴DNA樣本的LAMP引物，建立起一種快速分型方法。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA提取試劑盒購自Tiangen生化科技(北京)有限公司，dNTP(10mM each)購自Tiangen生化科技(北京)有限公司，Bst DNA聚合酶購自BioLabs公司。多房棘球蚴和細粒棘球蚴DNA為青海大學高原醫學研究中心保存品。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設計

在NCBI基因庫中，針對多房棘球蚴線粒體基因組序列(登錄號：NC 000928.2)和細粒棘球蚴線粒體基因組序列(登錄號：AF297617.1)，利用生物信息學軟件primerexplorer設計出兩組LAMP引物(表1)。引物由上海生工公司合成。

1.2.2 DNA提取及檢測

使用DNA提取試劑盒提取樣本DNA進行濃度檢測。稀釋到試驗所需濃度(2ng/μL)后通過電泳檢測DNA提取質量。

1.2.3 反應液配置

按要求配制25 μL反應液[10×Thermo Pol Buffer(2.5μL)；MgSO4(100mM，1.5μL)；dNTP Mix(10mM，3.5μL)；FIP(40μmol/L，1.0μL)；BIP(40μmol/L，1.0μL)；F3(5μmol/L，1.0μL)；B3(5μmol/L，1.0μL)；Bst DNA polymerase(8000U/mL，1.0μL)；LAMP可見光染料(1.25μL)；模板(2.0μL)；ddH2O(9.25 μL)]。

1.2.4 LAMP擴增條件設定

65 ℃下擴增60 min，82 ℃下延伸10 min。

1.2.5 LAMP擴增產物檢驗

擴增產物可直接通過觀察LAMP可見光染料顏色變化得出結果(陽性結果顏色由反應前的紫色變成天藍色，仍為紫色則是陰性)后吸取5 μL擴增產物行2%凝膠電泳檢測驗證(陽性結果為階梯條帶，否則為陰性)。

1.2.6 引物篩選

在多組引物中找出一組多房/細粒棘球蚴分型檢測結果最佳的，針對其所對應的線粒體基因，再設計一組該基因的引物進行驗證，從中選擇檢測效果最佳的引物組。

表1 ND2基因的LAMP引物序列Table 1 Primers used for ND2 gene

1.2.7 反應溫度優化

使用1.2.6中最優引物組尋找其最適反應溫度。以61 ℃～65 ℃為待選范圍，選出引物的最適反應溫度。

1.2.8 Mg2+反應濃度優化

使用1.2.6中最優引物組尋找其最適Mg2+反應濃度。以1.3～1.7×10-4mM為待選范圍、0.1×10-4mM為梯度重復試驗濃度選出引物的最適Mg2+反應濃度。

1.2.9 dNTP Mix反應濃度優化

使用1.2.6中最優引物組尋找其最適dNTP Mix反應濃度。以3.3～3.7×10-5mM為待選范圍、0.1×10-5mM為梯度重復試驗濃度選出引物的最適dNTP Mix反應濃度。

2 結果

2.1 ND2基因LAMP引物序列及位點圖的篩選

通過BLAST差異比對從多房和細粒棘球蚴線粒體ND2基因篩選出差異序列(圖1)，并在此基礎之上采用生物信息學軟件primerexplorer，針對線粒體基因組中ND2差異序列設計出了兩組用于區分多房和細粒棘球蚴的LAMP引物ND2A、ND2B序列及位點圖(圖1)。

A：ND2A(E.m.)的靶序列位點圖；B：ND2A(E.g.)的靶序列位點圖；C：ND2B(E.m.)的靶序列位點圖；D：ND2B(E.g.)的靶序列位點圖A：target sequence of ND2A(E.m.)；B：target sequence of ND2A(E.g.)；C：target sequence of ND2B(E.m.)；D：target sequence of ND2B(E.g.)圖1 ND2基因LAMP引物靶序列位點圖Figure 1 Targets sequences of primers for LAMP of ND2 gene

2.2 多房棘球蚴和細粒棘球蚴的DNA提取

分別從實驗室保存的多房棘球蚴原頭節和細粒棘球蚴原頭節中提取多房棘球蚴和細粒棘球蚴DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測確認其質量符合后續LAMP實驗要求(可用于LAMP擴增實驗，圖2)

1：DL2000 DNA marker；2：多房棘球蚴DNA；3：細粒棘球蚴DNA1：DL2000 DNA marker；2：DNA of Echinococcus multilocularis；3：DNA of Echinococcus granulosus圖2 DNA1%瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 2 Bands of DNA samples by 1% agarose gel electrophoresis

2.3 LAMP分型檢測引物的篩選及驗證

分別以多房棘球蚴DNA、細粒棘球蚴DNA、超純水、人源基因組DNA為模板，以設計獲得的ND2A(E.m.)、ND2A(E.g.)、ND2B(E.m.)、ND2B(E.g.)為引物進行LAMP擴增反應，之后通過瓊脂糖凝膠電泳及可視化探針對反應產物進行評價(圖3、4)：ND2A(E.m.)可準確擴增出多房棘球蚴目的序列而無法以細粒棘球蚴DNA為模板進行擴增，ND2A(E.g.)可準確擴增出細粒棘球蚴目的序列而無法以多房棘球蚴DNA為模板進行擴增，ND2B(E.m.)可準確擴增出多房棘球蚴目的序列而無法以細粒棘球蚴DNA為模板進行擴增，擴增效率較低，可視化探針無法檢測到；ND2B(E.g.)對多房棘球蚴DNA及細粒棘球蚴DNA均可擴增。ND2A這組引物可用于多房和細粒棘球蚴的分型檢測，而ND2B組引物無法準確區分多房和細粒棘球蚴DNA樣本。

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.)；C：ND2B(E.m.)；D：ND2B(E.g.)1：DL2000 DNA marker；2：多房棘球蚴DNA；3：細粒棘球蚴DNA；4：超純水；5：正常人的組織DNAA：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.)；C：ND2B(E.m.)；D：ND2B(E.g.)1：DL2000 DNA marker；2：DNA of Echinococcus multilocularis；3：DNA of Echinococcus granulosus；4：ultrapure water；5：DNA of normal human tissue圖3 ND2A引物和ND2B引物擴增結果的2%瓊脂糖電泳圖Figure 3 Results of ND2A and ND2B probes in 2% agarose gel electrophoresis

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.)；C：ND2B(E.m.)；D：ND2B(E.g.)1～4加入的模板順序為：多房棘球蚴DNA；細粒棘球蚴DNA；超純水；正常人的組織DNAA：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.)；C：ND2B(E.m.)；D：ND2B(E.g.)The order of the templates added to 1～4 is： DNA of Echinococcus multilocularis；DNA of Echinococcus granulosus；ultrapure water；DNA of normal human tissue

2.4 ND2A引物的反應溫度的優化

ND2A引物以61 ℃～65 ℃為待選范圍選出該組引物的最適反應溫度。如圖5所示，ND2A(E.m.)引物擴增效率自61 ℃到65 ℃呈先增加后減少的趨勢，故將ND2A(E.m.)的引物最適反應溫度定為64 ℃，而ND2A(E.g.)引物擴增效率自61 ℃到65 ℃呈逐步降低的趨勢，故將ND2A(E.g.)引物的最適反應溫度定為61 ℃。

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.).1：DL2000 DNA marker，2～6：61℃～65℃圖5 ND2A引物最適反應溫度的2%瓊脂糖電泳圖Figure 5 Optimum reactive temperature of ND2A probe in 2% agarose gel electrophoresis

2.5 ND2A引物的Mg2+反應濃度的優化

ND2A引物以1.3～1.7×10-4mM為待選范圍、0.1×10-4mM為梯度重復試驗濃度選出引物的最適Mg2+反應濃度。ND2A(E.m.)這一引物最適Mg2+反應濃度為1.5×10-4mM，ND2A(E.g.)這一引物最適Mg2+反應濃度為1.7×10-4mM(圖6)

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.).1：DL2000 DNA marker，2～6：1.3～1.7×10-4mM圖6 ND2A引物最適Mg2+反應濃度的2%瓊脂糖電泳圖Figure 6 Optimum Mg2+ reactive concen trationin ND2A probe by 2% agarose gel electrophoresis

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.).1：DL2000 DNA marker，2～6：3.3～3.7×10-5mM

2.6 ND2A引物的dNTP Mix反應濃度的優化

ND2A引物以3.3～3.7×10-5mM為待選范圍、0.1×10-5mM為梯度重復試驗濃度選出引物的最適dNTP Mix反應濃度。ND2A(E.m.)這一引物最適dNTP Mix反應濃度為3.4×10-5mM，ND2A(E.g.)這一引物最適dNTP Mix反應濃度為3.5×10-5mM(圖7)。

3 討論

自2013年以來，國內外的研究團隊完成了對多房棘球蚴[7]和細粒棘球蚴[8]的全基因組測序，這為棘球蚴的防治奠定了重要基礎。現階段已將PCR技術運用于棘球蚴的檢測[9]，PCR擴增具有精確敏感快速等優點，但需要熟練操縱技能的人才和昂貴的儀器(熱循環儀器)才能完成，造成該技術使用受到限制。而LAMP不但具有PCR的精確敏感快速等優點，還具備反應條件簡單便于直接觀察等彌補了PCR在基層不便于大規模應用的缺點，被廣泛應用于病原體的診斷和鑒別診斷：張偉陽[10]等研究發現LAMP可用于診斷結核分支桿菌；許靜[11]等研究發現LAMP可用于早期檢測日本血吸蟲感染家兔血清的特異性DNA；張超群[12]等研究發現LAMP可用于幽門螺旋桿菌檢測及分型研究；王岑[13]等研究發現LAMP可用于診斷日本血吸蟲的DNA。

Mohamed E[14]于2016年報道了實時LAMP法用于鑒定細粒棘球蚴G5和G6分型檢測、Salant H[15]于2012年報道了LAMP法用于細粒棘球蚴病原體的檢測、Ni X[16]于2014年報道了LAMP法用于多房棘球蚴終末宿主腸道內病原體及糞便中蟲卵的檢測，然而上述三項檢測方法不能同時對多房棘球蚴與細粒棘球蚴進行分型檢測。由于我國青海省三江源地區和四川省石渠縣等流行區屬于多房棘球蚴和細粒棘球蚴的混合感染區[17]，需要能夠準確區分兩種病原體的分子生物學方法，本研究旨在建立一種可以有效區分細粒棘球蚴和多房棘球蚴病原體的LAMP反應體系。

本研究進行了多房棘球蚴和細粒棘球蚴基因組的全序列對比，結果顯示這兩者的全基因組序列存在極大相似性，不利于分型檢測。由于多房棘球蚴和細粒棘球蚴線粒體序列相似性在95%以上，故通過常規的引物設計較難區分二者。本研究首先通過序列比對選擇了多房棘球蚴與細粒棘球蚴線粒體基因組中ND2基因中差異較大的序列，通過生物信息學軟件設計了兩組用于區分擴增二者的LAMP引物，經后續試驗驗證獲得了ND2A(E.m.)和ND2A(E.g.)用于有效區分二者，而ND2B(E.m.)和ND2B(E.g.)由于擴增效率、擴增特異性等原因無法有效區分。

LAMP擴增結果的檢測方法有多種：2%瓊脂糖凝膠電泳檢測法靈敏度高，但存在一定的缺點，如易造成污染引起假陽性結果且需要電泳儀等；目視渾濁法(陽性LAMP擴增結果會產生沉淀：dNTPs在Bst酶的作用下會產生PPi，PPi=P2O7，P2O74-和Mg2+作用會產生Mg2P2O7，Mg2P2O7是一種白色沉淀物，會使陽性擴增管產生渾濁)需要有經驗的檢測人員才能準確判斷；反應前、后加入染料觀測法(擴增前后顏色的不同)優于上述方法。

反應前、后加入染料觀測法最初采用SYBR greenⅠ，但因其不能特異性指示LAMP產物，并且在反應前加入會抑制反應的進行；需要在反應之后開蓋加入，易造成污染引起假陽性結果。之后采用鈣黃綠素，但鈣黃綠素需要和錳離子進行一定比例的配比才能達到檢測目的，且較不穩定。最后采用的是生物公司制備的LAMP可見光染料，陽性擴增結果會從原先的紫色變成天藍色，肉眼便可斷定結果，且該染料在反應前便加入反應體系中，既不會抑制反應進行也不需要開蓋加入而造成污染引起假陽性結果。

本實驗最終篩選出的ND2A引物，是針對多房棘球蚴和細粒棘球蚴線粒體基因組中的ND2基因設計的，其BLAST結果顯示為沒有明顯的相似性，為多房/細粒棘球蚴的分型檢測提供了有效方法。利用LAMP采用ND2A引物這一體系，初步建立起了一種多房/細粒棘球蚴分型的快速檢測方法，并進行了反應溫度的優化：ND2A(E.m.)的最適溫度為64 ℃，ND2A(E.g.)的最適溫度為61 ℃。上述工作將為后續應用于不同環境棘球絳蟲污染源的檢測奠定了前期實驗基礎。

本研究通過多房棘球絳蟲與細粒棘球絳蟲線粒體ND2基因設計，篩選獲得可用于分型鑒別多房/細粒棘球蚴的LAMP引物的方法，并進一步通過優化反應條件，建立了一種基于LAMP技術用于多房/細粒棘球蚴分型檢測的分子生物學方法。