藏藥五味沉香散對低氧大鼠海馬神經細胞損傷的保護作用*

嚴云飛，靳國恩，曹成珠，李曉娜，米國霞， 李生花

(青海大學醫學院，西寧 810001)

在實際應用中發現，五味沉香散(沉香、黃芪、川芎、酸棗仁、甘草)具有抗缺氧作用，但無理論依據。本研究通過相關實驗設計，明確其相關作用及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠購自西安交通大學醫學實驗動物中心[SCXK(陜)2017-003]。隨機分為低氧組(生理鹽水組，NS)、陽性對照組(紅景天組，HJT)、低氧藥物組(五味沉香散組，WW)，每組10只，均置低壓氧艙(模擬海拔5500m的低氧環境)中，30 d后取出腦組織，通過免疫組化和酶聯免疫吸附實驗法行HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2水平測定，同時制作腦組織形態學切片。

1.1.2 主要儀器、試劑

低壓氧艙購自中航風雷公司；電泳儀、電泳槽、ECL發光液購自Bio-Rad公司；RIPA、PMSF、4%多聚甲醛(815B0215)、2.5%電鏡固定液(P1126)均購自索萊寶公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏公司；BCA蛋白定量試劑盒、酶聯免疫吸附實驗試劑盒(E-EL-R0513c)購自武漢伊萊瑞特生物公司；PVDF膜購自Mil-Lipore公司；HIF-1α(ab179483)購自abcam公司；Beclin- 1 Antibody(ab6721)、Bcl-2(ab6940)購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 酶聯免疫吸附實驗方法

將標準品工作液依次加入兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL(若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品、樣本稀釋液稀釋后取樣)。酶標板覆膜：于每個孔中加入生物素化抗體工作液100 μL混勻，酶標板加上覆膜，孵育(37℃)90 min。甩盡孔內液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1～2 min，吸去或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干，重復此洗板步驟3次。每孔加酶結合物工作液100 μL，覆膜，溫育(37℃)30 min。棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每孔加90 μL底物溶液(TMB)，覆膜，避光孵育(37℃)15 min左右。加終止液(50μL)終止反應即刻用酶標儀在450 nm波長處測量各孔的光密度(OD值)。

1.2.2 免疫組化方法

1.2.3 統計學方法

實驗數據采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，進行方差分析，三組間兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 慢性低氧對三組大鼠腦組織Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1水平的影響

慢性低氧對三組大鼠腦組織Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1水平的影響結果見表1。

表1 低氧30天三組大鼠腦組織Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1 水平(OD值)Table 1 Brain tissue Bcl-2，HIF-1α and Beclin-1 levels of three groups of rats at 30 days of

* ：與NS比較，P<0.05

表1顯示，五味沉香散組Bcl-2水平顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。五味沉香散組HIF-1α水平顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。五味沉香散組Beclin-1水平顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。提示在低氧環境中五味沉香散可降低大鼠腦組織HIF-1α、Beclin-1的表達，同時可增高Bcl-2的表達，即可增加抗凋亡基因的表達，降低促凋亡因子及低氧誘導因子的表達，起到抗凋亡、缺氧的作用。

2.2 慢性低氧對三組大鼠腦組織形態學的影響

圖1 低氧30天三組大鼠腦組織切片圖(×40)Figure 1 Slides of brain tissue in three groups of rats at 30 days of hypoxia(×40)

圖1顯示：

Beclin-1在生理鹽水組細胞數量最多，細胞排列最亂；在紅景天組細胞數量稍有下降，細胞排列稍整齊；在五味沉香散組細胞數量最少，細胞排列最為整齊。

Bcl-2在生理鹽水組細胞數量最少，細胞排列紊亂；在紅景天組細胞數量稍有增多，細胞排列紊亂；在五味沉香散組細胞數量最多，細胞排列整齊。

HIF-1α在生理鹽水組細胞數量最多，細胞排列最亂；在紅景天組細胞數量稍有下降，細胞排列紊亂；在五味沉香散組細胞數量最少，細胞排列整齊。

3 討論

本研究探討五味沉香散對慢性低氧大鼠海馬神經細胞損傷的保護作用，通過五味沉香散對HIF-1α活性及大腦海馬組織中Beclin-1、Bcl-2表達的影響，確認其功效并初步考察作用機制。

內環境氧濃度的平衡是機體進行正常有氧代謝的必要條件，當暴露于低氧環境中，機體會立即產生應激和耐氧適應性反應，如心率加快、頭暈乏力、昏厥甚至窒息死亡等。HIF-1作為高度特異性的核轉錄因子，在細胞感知和適應內環境氧分壓變化的過程中，發揮著重要的作用[1]。它是一種異源二聚體，主要由120 kD的HIF-1α和91～94 kD的HIF-1β兩個亞單位組成，在低氧環境中，HIF-1的表達明顯增多。Bcl-2是一種抑制凋亡的線粒體內膜蛋白，具有抗細胞凋亡的功能[2]，基因及其表達蛋白可抑制多種細胞的凋亡，所以稱其為凋亡抑制基因。Bcl-2在正常的套區和邊緣帶中小B淋巴細胞和一些T細胞中有表達， 其表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一；它能夠阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，參與細胞凋亡的調控，抑制細胞凋亡。Bcl-2抗細胞凋亡的作用機制可能與抑制內質網管內鈣離子釋放有關[3]。Beclin-1基因也稱BECN1基因，是一種自噬相關基因，在自噬中發揮重要作用[4]，Beclin-1基因是參與自噬調控的重要因子，已證實在多種腫瘤組織及低氧組織中呈低水平表達[5]，它與Bcl-2基因相互拮抗調控自噬。

本研究將大鼠置于海拔5 500 m的模擬低氧環境中，分別用生理鹽水、五味沉香散及紅景天灌胃發現：暴露低氧30 d，五味沉香散組和紅景天組的HIF-1α及Beclin-1的水平均明顯低于生理鹽水組，與生理鹽水組相比具有顯著性差異；而五味沉香散組和紅景天組Bcl-2的水平明顯高于生理鹽水組，與生理鹽水組相比具有顯著性差異。說明在低氧條件下，五味沉香散可以降低Beclin-1及HIF-1α的表達，促凋亡基因Beclin-1表達減少，提示此藥物對細胞有保護、修復的作用；HIF -1α表達降低，提示此藥物具有抗缺氧的作用；Bcl-2表達增高，提示此藥物可以抑制神經元凋亡對腦細胞起保護作用。

綜上所述，五味沉香散對慢性低氧大鼠海馬神經細胞損傷有修復和保護作用。