OPN對低氧誘導的SD大鼠肺動脈平滑肌細胞自噬及增殖能力的影響*

鮑 金，劉川川，陳辛玲，劉輝琦，劉 杰，曹學鋒，王生蘭&

(1.青海大學醫學院；2.青海大學高原醫學研究中心；3.青海大學附屬醫院)

低氧性肺動脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是長期受慢性低氧等刺激而引起的一系列紅細胞增多、內皮細胞損傷、炎癥等病理改變，最終導致肺血管重塑的病理過程。低氧刺激會使機體血管活性物質分泌失衡，導致肺血管平滑肌細胞(Pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)異常增殖。HPH發生的機制復雜，但HPH動物模型中都存在明顯的PASMCs細胞增殖和肥大[1-3]，因而調控PASMCs的細胞增殖成為HPH研究和藥物開發的靶點[4-8]。

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種分泌型糖基化磷蛋白，廣泛分布在多種組織和細胞中，在動脈粥樣硬化、心肌肥大、心力衰竭、肺動脈高壓等心血管疾病的發展中，OPN都起著至關重要的作用[9-11]。OPN作為一種信號轉導分子，它可以通過與整合素結合或與CD44結合來干擾細胞增殖、遷移、自噬等過程。自噬(Autophagy)作為機體維持穩態的重要機制，主要通過溶酶體介導、回收利用細胞本身的蛋白質或細胞器[12]維持細胞自穩態。OPN對自噬的調控是雙向的：OPN可正向調控自噬增長[13-15]，也可負向調控自噬發生[16-18]。OPN是血管平滑肌細胞的細胞表型轉換的標志蛋白[19]，對HPH血管重塑意義重大。有研究發現OPN可以通過CD44和p38MAPK通路來調節自噬從而影響平滑肌細胞功能[20]。但在低氧情況下，OPN是否參與調控肺血管平滑肌細胞自噬未見報道。本課題擬通過低氧干預和RNA干擾、過表達技術，探討OPN在低氧下是否能夠調控PASMCs的自噬發生，為預防肺源性心臟病及其肺動脈高壓提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原代培養的大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs，課題組凍存品)。α-SMA抗體(武漢博士德公司，中國)，OPN抗體(Abcam公司，美國)，Beclin、LC3B一抗、辣根酶標記山羊抗兔二抗(ABclonal公司，中國)，胎牛血清、DMEM/F12培養基、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白Marker、細胞周期檢測試劑盒(賽默飛公司，中國)，PVDF膜(Millipore公司，美國)，EdU檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(碧云天公司，中國)，OPN過表達及干擾慢病毒(賽業生物，中國)。超凈工作臺、培養箱(賽默飛公司，中國)，流式細胞儀(艾森公司，美國)，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，全波長酶標儀(Tecan公司，瑞士)，蛋白質電泳儀、電轉儀(Bio-Rad公司，美國)，離心機(Eppendorf公司，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PASMCs培養

將凍存PASMCs置于37 ℃水浴鍋迅速溶解，離心棄上清液，加入含20%FBS的完全培養基，置于培養箱(37℃，3%CO2)培養，每隔3 d換液。待細胞生長至90%融合時，以0.25%胰酶(含0.001% EDTA)消化傳代培養。將3～7代細胞用于實驗。

1.2.2 PASMCs鑒定

1.2.3 實驗分組

細胞分為6組：常氧對照組(Normoxic)、低氧對照組(Hypoxia)、低氧+OPN干擾空病毒組(H+OPN EV)、低氧+OPN干擾慢病毒組(H+OPN shRNA)、低氧+OPN過表達空病毒組(H+OPN OEV)、低氧+OPN過表達慢病毒組(H+OPN shoRNA)。

1.2.4 細胞轉染

將處于對數期PASMCs(3×106個)接種傳代于35 mm培養皿中，待細胞長到合適濃度時進行細胞轉染(干擾序列見表1)。將病毒懸液稀釋為1×108TU/mL，轉染滴度定為1×107TU/mL。常氧對照組加無血清DMEM/F12培養基；低氧對照組加無血清DMEM/F12培養基；低氧+OPN干擾空病毒組加OPN空病毒；低氧+OPN干擾病毒組加OPN干擾慢病毒；低氧+OPN過表達空病毒組加OPN過表達空病毒；低氧+OPN過表達病毒組加OPN過表達慢病毒。轉染12 h時更換培養液，12 h后置于相應培養箱(常氧濃度21%，低氧濃度3%)處理48 h，收集細胞用于后續實驗。

表1 OPN慢病毒干擾序列Table 1 OPN lentivirus interference sequence

1.2.5 細胞增殖檢測

采用EdU法來評估細胞增殖能力。實驗前將細胞(約1×104個)分別接種于24孔板，細胞貼壁后，轉染相應OPN處理試劑，繼續培養24 h后，置于低氧培養箱(3%)處理48 h后移除原培養基，將200 μL包含EdU的新鮮DMEM培養基加入孔中。培養1 h后，移除EdU培養基，用4%多聚甲醛固定細胞20 min后將細胞用含有3%BSA的PBS洗滌兩次，每次5 min。將0.3%Triton X-100浸潤(室溫)15 min，然后用Click反應液在室溫下避光染色30 min，用Hoechst33342染色15 min。最后，使用Zessis熒光顯微鏡觀察并拍照分析。

1.2.6 細胞周期檢測

將細胞(約1×106個)接種于35 mm培養皿，孵育過夜后，再轉染相應OPN處理試劑，繼續培養24 h，用無FBS的DMEM培養基饑餓處理細胞16 h后，將細胞置于低氧培養箱(3%)處理48 h。收集細胞，用70%冰乙醇在4 ℃下固定12 h。離心除去乙醇，用PBS洗滌細胞兩次后染色。細胞在碘化丙啶溶液中重懸，于室溫下避光孵育20 min。使用流式細胞儀分析樣本。利用Novo Express軟件對采集到的數據進行分析。

1.2.7 Western blot 檢測

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PASMCs的免疫學鑒定

α-SMA免疫組化結果顯示，超過95%的細胞均能表達α-SMA(圖1)。細胞呈梭形，胞內肌絲明顯，鑒定所培養的細胞為平滑肌細胞。

2.2 調控OPN對PASMCs細胞增殖的影響

用EdU法評估干擾或過表達OPN后低氧刺激對PASMCs細胞增殖的影響，結果顯示：低氧干預能促進細胞增殖(P<0.05)；與低氧對照組相比，干擾OPN表達后其增殖能力減低(P<0.05)；而在OPN過表達后細胞增殖能力未發生明顯改變(P>0.05)(表2)。

圖1 α-SMA免疫組織化學染色鑒定圖(A 100×，B 400×)Figure 1 α-SMA immunohistochemical staining(A 100×，B 400×)

表2 調控OPN對細胞增殖的影響Table 2 The effect of OPN on cell

* ：與Normoxic組相比，P<0.05；#：與Hypoxia組相比，P<0.05

2.3 調控OPN對PASMCs細胞周期的影響

采用流式細胞術檢測干擾或過表達OPN后PASMCs的細胞周期，結果顯示：與常氧組相比，低氧能促進細胞周期進入S期(P<0.05)；與低氧組相比，OPN被慢病毒干擾后細胞周期阻滯于G0/G1期(P<0.05)；而OPN過表達后細胞周期無明顯變化(P>0.05)(圖2，表3)。

圖2 調控OPN對PASMCs細胞周期影響圖Figure 2 The effect of OPN on the cell cycle of PASMCs

表3 調控OPN對PASMCs細胞周期的影響結果Table 3 The effect of OPN on the cell cycle of

* ：與Normoxic組相比，P<0.05；#：與Hypoxia組相比，P<0.05

2.4 低氧對PASMCs自噬的影響

為探討低氧對PASMCs自噬的影響，采用Western Blot法檢測相關自噬蛋白表達，結果顯示：低氧處理后，能明顯增加OPN表達(P<0.05)，自噬相關蛋白Beclin、LC3B表達也增加(P<0.05)(圖3，表4)。

圖3 低氧對PASMCs自噬蛋白表達影響圖Figure 3 Effect of hypoxia on the expression of PASMCs autophagy protein

表4 低氧對PASMCs自噬蛋白表達的影響Table 4 Effect of hypoxia on the expression of PASMCs autophagy

2.5 調控OPN對PASMCs自噬的影響

為探討低氧下OPN干擾或過表達后對PASMCs自噬的影響，采用Western Blot法檢測自噬相關蛋白表達，結果顯示：與低氧組相比，低氧下OPN被慢病毒干擾后OPN表達明顯降低(P<0.05)，并引起自噬蛋白Beclin1、LC3B表達增加(P<0.05)(圖4，表5)；而在OPN過表達后OPN表達明顯增加(P<0.05)，并引起自噬蛋白Beclin、LC3B表達減少(P<0.05)(圖5，表6)。

圖4 干擾OPN對低氧下PASMCs自噬蛋白表達的影響圖Figure 4 Effect of OPN interference on the expression of autophagy protein in PASMCs under hypoxia

表5 干擾OPN對低氧下PASMCs自噬蛋白表達的影響Table 5 Effect of OPN interference on the expression of autophagy protein in PASMCs under

* ：與Hypoxia組相比，P<0.05

圖5 過表達OPN對低氧下PASMCs自噬蛋白表達的影響圖

表6 過表達OPN對低氧下PASMCs自噬蛋白表達的影響結果Table 6 Effect of OPN overexpression on the expression of PASMCs autophagy protein under

* ：與Hypoxia組相比，P<0.05

3 討論

HPH是肺動脈高壓(Pulmonary hypertens，PH)的一種常見類型，是低氧刺激導致的肺動脈壓力增高，并伴有相應結構改變。短時間急性缺氧引起肺血管收縮，長時間慢性缺氧可導致肺血管重塑[21]。而PASMCs細胞增殖在驅動肺動脈高壓血管重塑[22]發生中有著至關重要的作用。低氧涉及廣泛的細胞反應，如細胞增殖、炎癥等。低氧促進PASMCs增殖，此與我們的研究結果一致。但低氧引起PASMCs細胞增殖的機制不明，Zhu B等人發現MEG3可調控miR-21/PTEN通路來影響PASMCs細胞的增殖[23]。Jihui Lee 等證明miRNA可通過介導CKI來影響低氧引起的血管平滑肌的增殖(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)[24]，Gu Q等人研究表明低氧下PASMCs的細胞增殖可能與干細胞因子相關[25]，但低氧到底如何促進PASMCs的細胞增殖，其具體機制還有待進一步研究。

OPN作為一種廣泛存在于各種細胞中帶負電的磷酸化糖蛋白[26-27]，與心血管疾病、糖尿病和腫瘤密切相關[28]。OPN可以調控細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡和自噬過程[16]。OPN的表達被認為是VSMCs由收縮表型向合成表型轉變的標志之一[29]。本研究發現低氧可促進OPN的表達，該結果與其他學者的結果不謀而合[30-31]。通過OPN特異性慢病毒感染OPN表達后，在低氧下能抑制PASMCs的細胞增殖，并將細胞周期阻滯于G0/G1期，此與其他學者的研究結果相一致[32-33]。但在OPN被過表達病毒轉染后，PASMCs在低氧下的增殖并未進一步增加，細胞周期檢測結果也與低氧下無差異，這可能是OPN與低氧通過參與相似的機制對PASMCs的增殖起促進作用。結果表明，OPN參與了低氧性肺動脈高壓血管重塑的形成。

自噬作為機體一種保守的“自我吞噬”，自噬過程中細胞質組分被降解并循環利用以維持細胞穩態[34-36]。在哺乳動物中，LC3存在LC3A、LC3B和LC3C等三種亞型，但目前研究最廣的還是LC3B，不少研究都將其視為自噬的關鍵基因，它與自噬體的成熟相關，是監測自噬活性的重要蛋白。Beclin是反映自噬活性的重要基因，參與自噬調控。這兩者能很好地反映自噬的活性。OPN可以通過調控細胞自噬參與許多疾病的發生。在蛛網膜下腔出血中，OPN可增強自噬、減少凋亡[37]，減輕早期腦損傷；在結直腸癌中，OPN對自噬和凋亡都起到抑制作用[16]。由此可見OPN在調控自噬過程中表現出雙向作用：既可抑制自噬，也可促進自噬的發生。OPN調控自噬的機制復雜，可能與p38MAPK信號通路有關[16]；也與通過跟細胞表面的不同受體結合，誘導多種基因和信號通道蛋白的表達[38-40]有關；還可與CD44結合有關[20]。本實驗對自噬的研究發現，單純低氧干預下自噬相關蛋白Beclin1、LC3B表達增加，表明低氧刺激本身會引起自噬的發生，此與其他學者的研究結論一致[41-43]。而在低氧情況下使用OPN特異性干擾慢病毒降低OPN表達后，能促進自噬相關蛋白Beclin1、LC3B的表達；相反，在使用OPN過表達慢病毒后，其抑制了自噬相關蛋白Beclin1、LC3B的表達。由此推斷，OPN對低氧下PASMCs的自噬過程有抑制作用，與其他學者的研究結論一致[16-18]。OPN調控低氧誘導的細胞自噬并影響細胞增殖的分子機制未完全闡明。有研究表明，低氧刺激下能促進組織血管新生[44]；而在缺乏自噬蛋白Beclin1的小鼠表現出與低氧有關的促血管生成表型[45]；在缺氧培養的人肺血管細胞中，自噬激活抑制了這些血管細胞的低氧增殖[46]。本研究中，低氧情況下使用OPN特異性干擾慢病毒減低OPN表達后，能減弱PASMCs細胞增殖，增強自噬相關蛋白Beclin1、LC3B表達。推斷OPN的增強可抑制自噬的激活，從而增強PASMCs細胞增殖能力。

因此，我們證實低氧本身能促進PASMCs增殖，并誘發自噬的發生；同時OPN參與了低氧下肺動脈平滑肌細胞的自噬過程。OPN表達增加可能以直接或間接方式抑制PASMCs自噬發生，共同促進PASMCs增殖。OPN可能是調控低氧性肺動脈高壓肺血管重塑的藥物靶標。但OPN調控低氧誘導的PASMCs自噬的分子機制還有待進一步研究。