慢性高原病患者發生血栓與血漿EMP和P-選擇素水平的關系※

王卓亞，楊發滿，汪雪萍，旦增諾揚

(1.青海大學附屬醫院，青海 西寧 810001；2.青海大學高原醫學研究中心，青海 西寧 810001)

大量研究表明慢性高原病(Chronic Mountain Sickness，CMS )患者凝血功能異常，發生血栓和出血的風險均升高[1-3]。慢性高原病出血風險增高與凝血因子減少和血小板減少有關，慢性高原病血栓形成與什么有關目前了解有限。本研究旨在了解EMP和P-選擇素與慢性高原病患者發生血栓的關系。

內皮細胞微粒(Endothelial Microparticles，EMPs)是內皮細胞在激活或凋亡狀態下所釋放的微小、不含細胞核的囊泡狀物質，大量研究證實EMPs可以反映內皮細胞的損傷狀況[4-5]，CMS患者由于缺氧，可使血管內皮廣泛受損，從而可能促進炎癥因子的釋放致凝血系統激活，促進血栓形成。P-選擇素(P-selectin)是PLT活化時釋放于血漿中介導活化PLT和內皮細胞、白細胞和內皮細胞之間的黏附作用，是PLT活化釋放的特異標志物，其水平升高與血栓的發生密切相關[6]。本研究擬通過相關方法明確慢性高原病患者發生血栓與血漿EMP、P-選擇素水平之間的關系。

1 資料與方法

1.1 樣本選擇

選取2016年12月～2018年9月入住青海大學附屬醫院的慢性高原病合并深靜脈血栓患者20例入CMS+T組(年齡46.00±8.60歲，海拔3216.5±332.8米)、慢性高原病患者40例入CMS組(年齡45.63±9.34，海拔3387.5±413.1米)；選取同期就診我院的世居高原健康體檢者(海拔2500米及以上)40例入高原control組(年齡43.83±11.12歲，海拔3228.5±314.6米)。以上受試者均為漢族、男性，各組間年齡、居住海拔無統計學差異(P>0.05)。慢性高原病標準符合2004年慢性高原病青海標準[7]。對慢性高原病組有深靜脈血栓癥狀的患者，完善下肢靜脈CTV和肺動脈CTA檢查以確診深靜脈血栓排除肺栓塞。CMS患者排除真性紅細胞增多癥、骨髓增殖性疾病及由于肺部疾患及睡眠障礙導致的繼發性紅細胞增多癥。所有受檢者近3月均未使用影響凝血功能及血小板功能藥物。本研究經青海大學附屬醫院倫理委員會審查同意，所有患者及志愿者均已簽署書面同意書。

1.2 血常規及凝血指標測定

所有受檢者抽取空腹靜脈血2 mL于EDTA管中，應用全自動血細胞分析儀(SYSMEXXE-2100)測定血常規；高原對照組抽取2 mL靜脈血，CMS患者抽取3.6 mL于檸檬酸鈉管中用全自動凝血功能儀(SYSMEX-CA7000)測定凝血功能。

1.3 EMPs水平測定

所有受檢者在治療前抽取空腹靜脈血5 mL于EP管中，離心(160g，20min)獲取富血小板血漿，吸取上層(2/3)血漿離心(1000g，20min)獲取乏血小板血漿。將特異性熒光標記抗體(anti-CD31-PE，anti-CD42-FITC)0.5 μg或等量的同型對照抗體加入到50 μL的乏血小板血漿中，室溫孵育30 min，隨后加入1 mL PBS液后采用流式細胞儀(美國BD公司-FACSCantoII )檢測，標本上機前用0.1～1.0 μm的標準進行前項角設門，門內收集的微粒進行FITC和PE熒光強度分析。EMPs定義為直徑0.1～1.0 μm且CD31+/42b-的微粒。

1.4 P-選擇素測定

所有受檢者未治療前抽取肘靜脈血5 mL，離心(1000g，10min)取血漿于EP管中，用P-選擇素試劑盒(上海遠慕)測定標本血漿含量。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0軟件包進行數據處理。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩個變量之間的關系采用Pearson直線相關分析，危險因素采用Logistic回歸，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 三組間的血紅蛋白、血小板和凝血功能與EMPs、P-選擇素水平比較

CMS+T組及CMS組血紅蛋白明顯高于control組，差異有統計學意義(P<0.05)；CMS+T組及CMS組之間血紅蛋白水平無統計學差異(P>0.05)。血漿EMPs、P-選擇素水平在高原對照組和CMS、CMS+T組均依次升高，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，結果見圖1-1～3；CMS+T 組D-二聚體水平高于CMS組和Control組，差異有統計學意義(P<0.05)；③CMS組和CMS+T組PT、APTT長于Control組(P<0.05)，CMS組和CMS+T組PLT低于Control組(P<0.05)，慢性高原病合并血栓組與CMS組之間無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組之間EMPs、P-選擇素、Hb、PLT和凝血指標的比較Table 1 Comparison of EMPs，P-selectin，PLT and coagulation indicators among three

* ：與CMS組比較，P<0.05；△：與對照組比較，P<0.05

1-1 CMS+T組EMPs水平1-2 CMS組EMPs水平1-3 control組EMPs水平

上述結果提示慢性高原病患者無論是否合并血栓與高原健康組比較，其血小板減少，PT、APTT延長，提示慢性高原病患者存在凝血功能異常，具有出血傾向；同時EMPs、P-選擇素、D-二聚體升高，提示存在血栓發生的風險，即慢性高原病患者存在出血和血栓的雙重風險。D-二聚體在血栓組明顯升高，與其他兩組差異有統計學意義，支持D-二聚體是血栓形成的評估指標，但其是血栓形成后的結果，我們此次研究的目的是確定對血栓的形成的可能影響因素。

2.2 CMS患者發生血栓的危險因素分析

分析慢性高原病組和慢性高原病合并血栓組患者的臨床資料，EMPs、P-選擇素、Hb的升高可能是血栓的形成原因，PLT減少、PT和APTT延長可能是血栓形成的抑制因素，故將CMS是否發生深靜脈血栓作為因變量，將EMPs、Hb、PLT、PT、APTT 和P-選擇素作為自變量，并進行賦值(表2)做Logistic回歸分析。結果顯示，血漿EMPs水平是慢性高原病血栓發生的獨立危險因素，OR=9.947，P=0.005，PT是慢性高原病預防血栓發生的保護性因素，OR=0.134，P=0.017(表3)。提示慢性高原病患者隨著血漿EMPs水平升高，發生血栓的風險度升高，隨著PT的延長，發生血栓的風險度降低。臨床上可以通過檢測血漿EMPs、PT來判定該患者發生血栓的風險度。

表2 CMS指標變量數量化及賦值表Table 2 Quantification for variables of chronic mountain sickness

表3 CMS患者發生血栓的危險因素Table 3 Risk factors for thrombosis in CMS patients

2.3 EMPs、P-選擇素與凝血指標的相關性分析

CMS+T組EMPs水平與P-選擇素呈中度正相關，EMPs與D-二聚體呈中度正相關，P-選擇素與凝血指標無關，見圖2～3。

圖2 EMPs和P-選擇素關系的散點圖Figure 2 Scatter plot of the relationship between EMPs and P-selectin

圖3 EMPs與D-二聚體的散點圖

3 討論

血栓形成的原因有心血管內皮系統的受損、血流的紊亂、血液成分的改變等。CMS患者一方面因慢性缺氧刺激導致紅細胞代償性增加，使血液具有“濃、黏、聚、凝”的特點[8]，血流紊亂易發生血栓栓塞性疾病；另一方面，高原低氧可導致血管內皮細胞發生損傷，從而導致內皮細胞功能紊亂[9]，激活機體內、外源性的凝血途徑，使血液呈高凝狀態。因此尋找CMS發生血栓的危險因素，提前給予干預治療，對改善CMS 的凝血功能狀態具有重要的臨床意義。

本研究發現，EMPs和P-選擇素在高原健康對照組、慢性高原病組、慢性高原病合并血栓組依次升高。血漿中EMPs水平是新近發現的一種評估內皮功能損傷的方法[10]，慢性高原病患者由于長期缺氧導致廣泛內皮系統受損[9]，表現為血管內皮屏障作用減弱，信息傳遞及分泌能力下降，擴血管物質自分泌能力下降，縮血管物質相對增加，白細胞黏附及血小板聚集度增強，抗凝血功能出現障礙，抗血栓作用下降，出現血液的高凝狀態[11]。本研究中慢性高原病合并血栓患者EMPs 水平最高，提示內皮系統受損最為嚴重，推測其繼而可引起局部血管收縮、白細胞黏附、炎癥反應增重、血小板聚集增強，出現局部血栓。慢性高原病組患者雖然沒有影像學提示的靜脈血栓，但由于低氧、血流淤滯緩慢，對內皮系統仍有一定程度的損傷，所以EMPs在三組間遞減。Logistic回歸結果提示，EMPs是慢性高原病發生血栓的獨立危險因素，相關性研究提示：EMPs與D-二聚體水平存在一定的相關性，故在慢性高原病組患者行血漿EMPs檢查對于判斷該類患者發生血栓的風險度有一定的指導意義。

P-選擇素屬于選擇素家族的一種，主要存在于內皮細胞的棒管狀小體內或者血小板α顆粒中。血清中的可溶性 P-選擇素分子是在內皮細胞損傷或血小板活化時釋放到血液中形成的，可作為機體內血栓形成的診斷靶標[12]。血漿中P-選擇素基礎水平較低主要來源于血小板，而在疾病狀態下高水平的P-選擇素水平則主要由活化的內皮細胞分泌[13]和活化的血小板釋放，使得血清可溶性 P-選擇素表達水平明顯升高，進而介導血小板或血管內皮細胞與中性粒細胞、單核細胞的相互黏附作用，最終促進血管內血栓的形成[14，15]，使機體處于高凝狀態。在本研究中慢性高原病合并血栓組P-選擇素水平最高，慢性高原病組次之，高原對照組最低，與EMPs在三組間的水平趨勢一致，我們進行了EMPs與P-選擇素的相關性分析，發現兩者之間存在顯著的中等程度的正相關，也進一步支持了疾病狀態下高水平的P-選擇素水平主要由活化的內皮細胞分泌和內皮受損引起血小板活化所致。同時提示在慢性高原病發生血栓的風險度增高。

此次研究中發現慢性高原病患者和合并血栓患者血小板減少，分析原因可能與以下因素有關：①長期缺氧會使巨核細胞成熟障礙，使巨核細胞數目下降[16]，同時紅細胞和血小板的前體細胞存在著競爭關系，慢性高原病患者紅細胞增多，紅系祖細胞增殖抑制了巨核系的增殖[17]。②慢性高原病患者血小板活化增多，導致消耗增多[18]。在分析CMS患者形成血栓的危險因素時發現，血小板水平降低并不是預防血栓發生的保護性因素，可能與部分血小板減少使其活化、消耗過多有關，而血小板活化是會增加血栓風險的。

同時我們還發現慢性高原病組及慢性高原病合并血栓組PT、APTT延長。據本課題組先前研究發現：慢性高原病患者FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ水平降低，提示慢性高原病患者內源性和外源性凝血功能障礙與凝血因子的減少有關。故慢性高原病患者和同時合并血栓的患者出血風險度增高，分析慢性高原病患者發生血栓的危險因素發現，PT是血栓發生的保護因素，PT越長，提示發生血栓的風險度越低，可據此指標結合其他指標來判斷血栓及出血發生的風險程度。

綜上所述，慢性高原病患者合并血栓患者血漿EMPs、TF-MPs水平升高，血漿EMPs水平與D-二聚體有一定的相關性。臨床上我們通過動態監測PT、APTT可以判斷出血風險度，同時我們可以結合血漿EMPs、PT來判斷發生血栓的危險程度。