2017 -2018 年山東省豬流行性腹瀉病毒ORF3 基因型分析

(山東省動物疫病預防與控制中心,山東濟南 250022)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性的腸道疾病。該病毒主要破壞豬的消化道器官,其主要臨床癥狀為急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水。1971年,英國首次報道了PED 的發生[1]。1978 年,英國和比利時首次鑒定PEDV 的基因組大小約為28 kb,是具有感染性的、有囊膜、不分節段的、單股正鏈RNA 病毒。PEDV 基因組從5′→3′依次為5′端非編區(5′untranslated region,UTR),6 個開放閱讀框(Open reading frames,ORFs)和3′UTR,其中5′端含有帽子結構,3′端含有Poly(A)尾巴,6 個開放閱讀框包括復制酶基因(ORF1a,ORF1b)和結構基因(S、ORF3、M、N)[2]。ORF3 屬于附屬蛋白,在病毒復制的過程中,一般不需要附屬蛋白的參與,但附屬蛋白的表達可能對病毒適應體外培養過程產生影響。將病毒在細胞上進行連續傳代后,就很容易從中挑選出附屬基因缺失的毒株,而其缺失可以導致病毒的至弱[3],因此現認為ORF3 蛋白的功能與病毒的毒力有關,并為強、弱毒株提供了鑒定依據。

本試驗對2017 年1 月-2018 年6 月山東省13地市仔豬臨床表現為腹瀉癥狀的規?；i場開展了病原檢測和ORF3 基因分析,為更好的PEDV 防控提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 研磨儀、PBS、離心機、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀、AB 熒光定量PCR 儀,均由本實驗室提供;病毒DNA/RNA 提取試劑盒、質粒提取試劑盒、Prime Script One Step RT-PCR kit Ver.2、pMD18-T Simple Vector、克隆宿主菌E.coliDH5α 感受態細胞、DL-2 000 DNA Marker,均購自TaKaRa 公司。

1.1.2 引物設計 參照GenBank 已登錄的PEDV序列JQ282909 的ORF3 基因,利用Primer 5.0 設計PEDV 的ORF3 基因擴增引物(ORF3f:5′-CCTAGACTTCAACCTTAC-3′;ORF3r:5′-GAAAAAGAGTACGAAAAG-3′)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 于2017 年1 月-2018 年6 月,從山東省德州、泰安、煙臺、濟寧、濟南、日照、菏澤、臨沂、濱州、濰坊、聊城、淄博和東營13 個地市豬場采集腹瀉仔豬的小腸及內容物、新鮮糞便和血清等樣品共105 份。

1.2.2 RNA 的提取 將采集的豬小腸及內容物、糞便放入1.5 mL 離心管中,加入磁珠、1 mL PBS,用組織研磨儀研磨,離心取200 μL 上清。按照AxyPrep 體液病毒RNA Extraction Kit 步驟進行RNA的提取。

1.2.3 陽性病料的篩選和ORF3 基因的擴增與克隆 利用豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒三重實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒(世紀元亨)將鑒定陽性的病料用于ORF3 基因的克隆。用PEDVORF3 引物對樣本進行PCR 擴增,反應體系為50 μL。模板RNA 2 μL,RNase Free dH2O 17 μL,2 ×1 Step Buffer 25 μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL,上下游引物各2 μL。條件:50 ℃30 min,95 ℃5 min,1 個循環;94 ℃30 s、50℃30 s、72 ℃30 s,30 個循環;72 ℃10 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,篩選出陽性樣本。膠回收產物連接于pMD18-T 載體中,將鑒定結果為陽性的質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4ORF3 基因的遺傳進化分析 將獲得的序列命名并上傳NCBI 數據庫,利用Meg Align 軟件將本試驗獲得的ORF3 基因序列與我國其他地區的代表株、國外分離株及PEDV 經典株的ORF3 基因進行同源性分析比對并構建遺傳進化樹。

2 結果

2.1ORF3 目的基因擴增與序列測定 2017 -2018 年,來自山東省13 個不同地市的105 份腹瀉病料中,利用M 系列引物檢出68 份陽性,年均檢出率為64.8%。利用ORF3f 與ORF3r 一對特異性引物篩選出28 株具有代表性的陽性病毒株。將篩選出的28 株ORF3 序列連接T 載體測序,從中擴增ORF3 全基因,大小為675 bp,部分電泳結果見圖1。

圖1 PEDV ORF3 基因的RT-PCR 擴增結果

2.2 基因序列比對 利用Meg Align 序列比對發現未出現基因的缺失,只是發生個別基因的突變。28 株ORF3 基因彼此同源性為94.2%～100%,編碼氨基酸同源性為94.7%～99.6%。與歐洲經典毒株CV777 基因同源性為95.4%～96.9%,氨基酸同源性為94.4%～96.0%。28 株序列號分別是MH580562-MH580589。毒株的詳細信息見表1。

與CV777 相比,本試驗獲得的28 個ORF3 序列在8 個位點發生相同的氨基酸的變異(A21V,I54V,I79V,F92L,V80S,I101A,S166N),同時還存在一些特異性的突變(L3S,G4W,L5T,Q7S,T9M,L25S,I70M,L72S,L81I,L132P,G150V,N168D,H182Q)。與疫苗株Attenuated Chinese PEDV 相比,不存在82～99氨基酸位點上18 個氨基酸的連續缺失現象,結果驗證本試驗分離得到的28 株序列均為野毒株。

表1 分離毒株信息

2.3ORF3 全基因遺傳進化分析 將28 株本試驗分離的ORF3 基因與NCBI 已上傳部分ORF3 基因做遺傳進化分析(表2),遺傳拓撲圖(圖2)呈現2 個明顯的分枝,經典毒株與弱毒株代表的G1 和當代流行毒株群代表的G2。G1 包含2006 年在甘肅分離得到的中國毒株LZC 和1978 年在比利時首次發現的PEDV 歐洲株CV777,以及1 個韓國弱毒株和3 個中國弱毒株。野毒株群G2 包含2 個分枝,以韓國野毒株和中國野毒株為代表的2-1,和以山東毒株與華南毒株為代表的2-2。本試驗分離的22 株野毒株與5 株韓國流行株和3 株中國流行株聚類于2-1 分支中,拓撲圖顯示,該分支病毒是由韓國經典毒株Virulent DR13 變異而來。其余6 個山東省流行毒株與2011 -2012 年分離得到的5 個廣東野毒株和1 個福建野毒株聚類在一起,拓撲圖顯示,該分支的山東省流行病毒株和廣東省流行病毒株與福建省的P9 病毒株起源于共同的祖先。

表2 參考序列信息

3 討論

PEDV 屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus),是有囊膜的不分節段的單股正鏈RNA 病毒[4-5]。多項研究證實,PEDV 毒株目前只存在1 種血清型[6]。自PEDV 流行以來,成為造成仔豬腹瀉死亡的主要原因[7],即使在免疫豬場,感染該病毒的仔豬死亡率高達100%[8],給養豬業帶來巨大經濟損失。本試驗對山東省13 地市發生腹瀉的豬進行臨床診斷和PCR 技術相結合,確定2017 -2018 年PEDV 在山東的流行情況。

圖2 PEDV ORF3 遺傳進化分析

PEDV 病毒目前分為3 個基因型:經典型、弱毒型和流行型[9]。其ORF3 基因在病毒進化史上相對保守,但不同流行地區野毒株的ORF3 基因也存在一定的特異性差異,因此開展ORF3 基因的分子流行病學調查,對于PEDV 的區域性防控具有重要意義。本試驗獲得的28 株野毒株PEDVORF3 基因測序結果顯示,ORF3 基因只存在個別位點的突變,沒有發生缺失和插入,大小均為675 bp,編碼224 個氨基酸。遺傳分析顯示,2 -1 分支與經典毒株CV777和LZC 親緣關系較遠,但與韓國毒株親緣關系較近,病毒是否由韓國流入還需進一步證實。雖然進化樹拓撲圖顯示,山東和廣東的流行毒株與福建P9具有相同的進化地位,但2-2 分支毒株最早出現在中國廣東[10-11],并在華南個別省份持續存在2 年左右。這一類型PEDV 流行株具有強致病性,引起仔豬100% 高死亡率。2015 年在山東省被檢測發現[12],直到現在該分支病毒仍在山東境內流行,其他地區再無報道。

由此我們得出2 點推論:推論1,是否2-1 亞型分支是由2-2 分支病毒變異而來? 2-1 與2-2 分支比較來看,2-2 分支的進化地位較2-1 靠前,病毒序列比較保守,沒有引起大規模疫病的流行,只是散狀零星發生。推論2,2-2 亞型是否適合做我國PEDV疫苗的備選毒株? 除了廣東、湖北、福建和山東四省檢測到該亞型的病毒,其他地區包括國外均無報道,且從2013 年以來,華南沒有再發生該亞型引起的家畜PEDV 感染事件。畢竟地域不臨近,我們無法推測山東省檢測到的2-2 亞型是從華南流入本地,但是該亞型毒株流行較慢,序列較保守,是否適合研發成新的PEDV 疫苗株還需進一步理論和試驗驗證。山東省是農畜產品生產和交易大省,大量的畜產品交易再加上交通運輸環節的防護和消毒的不到位,給疫病防控增加了重重困難。總之,這種現象警示我們應注意這一基因型病毒的流行和變異情況,預防該基因型PEDV 的大規模暴發。