塞內卡谷病毒實時熒光RT-PCR 方法的建立

林彥星 ,徐 錚 ,曹琛福 ,黃超華 ,王 瀟 ,張彩虹 ,楊俊興,花群義

(1.深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心,廣東深圳518045 ;2.華南農業大學動物科學學院,廣東廣州510642 ;3.華南農業大學獸醫學院,廣東廣州 510642)

塞內卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、塞內卡病毒屬(Senecavirus)、A 型塞內卡病毒(SenecavirusA)的唯一成員,為不分節段的單股正鏈RNA 病毒[1]。最初SVV 被認為是一種非致病性病毒,有關SVV 的研究主要是作為溶瘤病毒用于治療人類某些神經內分泌腫瘤[2-3]。2014 年巴西暴發大規模SVV 導致仔豬死亡,國內外養豬業對該病毒才重視起來[4-5]。2015 年我國研究人員首次分離到SVV 中國毒株并測定了其全基因組序列[6],近兩年來我國先后有湖北、福建、河南、廣東等省部分豬場出現SVV 感染的情況[7-9]。

該病是近年來發現的由塞內卡谷病毒感染引起豬出現水泡性病變的一種傳染病。其特征是引起豬鼻鏡及蹄冠處出現水皰、潰爛創面從而導致跛足甚至死亡,臨床癥狀與口蹄疫(Foot-and mouth disease,FMD)、豬水皰病(Swine vesicular disease,SVD)等我國一類動物傳染病相似,建立及時準確的診斷檢測方法對疫病防控意義重大。目前國外已經建立了多種檢測SVV 病原檢測方法,如電子顯微鏡檢查、免疫組化、RT-PCR、熒光定量RT-PCR、新型RNA 原位雜交技術等均可用于SVV 的鑒別檢測[10-12]。本研究通過設計特異性的引物和探針,建立了檢測SVV 的實時熒光RT-PCR 法,為有效防控塞內卡病毒病提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒、核酸樣品和細胞 塞內卡谷病毒(SVV)由本室保存。水皰性口炎病毒(VSV)、豬水皰病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等滅活病毒抗原以及PK15 細胞均由本動植物檢驗檢疫技術中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 見參考文獻[13]。

1.3 引物探針的設計 根據NCBI GenBank 中公布的SVV 基因序列(KT321458.1),針對3D 和VP1目的基因,設計多對普通RT-PCR 引物和實時熒光RT-PCR 引物及探針組合,利用BLAST 初步比較其特異性。引物探針合成后通過試驗篩選并對反應條件進行優化。

1.4 病毒核酸的提取 采用病毒RNA 抽提試劑盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit 在全自動磁珠提取純化系統上提取病毒核酸,用50 μL 洗脫液洗脫,并用超微量核酸蛋白濃度分析儀測定所提取核酸濃度。SVV 陽性對照樣品,先制備PK15 單層細胞,將SVV 接種于PK15 細胞,每日觀察細胞病變,待細胞病變達75%時,收獲病毒培養液,同法提取病毒核酸。

1.5 普通RT-PCR 擴增 使用一步法RT-PCR 擴增試劑盒(QIAGEN),分別以SVV、VSV-IND、VSVNJ、SVDV、FMDV、CSFV 和PRRSV 等核酸為模板進行RT-PCR 檢測,并以無核酸酶水(DEPC 水)為模板作為空白對照。RT-PCR 擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。陽性PCR 產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 實時熒光RT-PCR 特異性試驗 采用一步法熒光定量RT-PCR 試劑盒(ABI),以SVV、VSV-IND、VSV-NJ、SVDV、FMDV、CSFV 和PRRSV 等病毒核酸為模板進行實時熒光RT-PCR 檢測,并以DEPC 水作為空白對照。

1.7 實時熒光RT-PCR 靈敏度試驗 用DEPC 水對所SVV 核酸做10 ×系列稀釋,以稀釋的核酸為擴增模板進行實時熒光RT-PCR 試驗。

1.8 實時熒光RT-PCR 重復性試驗 采用1.2.5中3 份不同濃度(10-1～10-3)的SVV 核酸模板進行批內重復性試驗和批間重復性試驗。根據Ct值變異系數(CV)進行重復性評價。

1.9 臨床樣品檢測 利用本研究所建立的方法,對本實驗室收集的116 份臨床樣品進行檢測,并以SVV 核酸作為陽性對照,DEPC 水作為陰性對照;同時也采用普通RT-PCR 方法進行檢測。

2 結果

2.1 引物探針篩選 通過試驗篩選出特異敏感的普通RT-PCR 引物和實時熒光RT-PCR 引物探針(見表1)。

表1 RT-PCR 引物和探針序列

2.2 反應條件的確立 按照RT-PCR 擴增試劑盒說明書要求,在25 μL 反應體系中,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),RNA 核酸模板5 μL,用DEPC 水補足25 μL。經過對退火溫度和時間的優化,確定RT-PCR 最佳反應條件:50 ℃30 min;95 ℃15 min;94 ℃30 s,52 ℃40 s,72 ℃1 min,40 個循環;72 ℃10 min。實時熒光RT-PCR 反應體系同樣為25 μL,其中上下游引物各1 μL(10 μmol/L),探針0.5 μL(10 μmol/L),模板5 μL;按試劑盒推薦的反應條件:45 ℃10 min;95 ℃10 min;95 ℃15 s,60 ℃45 s(收集FAM 熒光),40 個循環。

2.3 普通RT-PCR 擴增結果 普通RT-PCR 擴增產物凝膠電泳結果顯示,僅SVV 核酸模板出現約372 bp 條帶,大小與預期相符,PCR 產物經測序后通過GenBank Blast 比對分析,表明擴增片段與目的基因相符,為SVV 核酸序列;其他核酸模板及空白對照均未出現擴增條帶(圖1)。

2.4 實時熒光RT-PCR 特異性試驗結果 以SVV、SVDV、VSV-IND、VSV-NJ、FMDV、CSFV 和PRRSV等核酸為模板進行實時熒光RT-PCR 特異性檢測。結果顯示,以SVV 核酸為模板的反應孔收集到FAM熒光信號,出現典型的擴增曲線,而其他核酸模板和空白對照都未出現擴增曲線(見中插彩版圖2),表明該方法特異性強,能準確檢測SVV 核酸,與其他病原無交叉反應。

圖1 普通RT-PCR 擴增結果

圖2 實時熒光RT-PCR 特異性檢測結果

2.5 實時熒光RT-PCR 靈敏度試驗結果 測得所提取核酸濃度為0.72 μg/mL。用DEPC 水將SVV核酸做10 × 系列稀釋(100～10-6)進行實時熒光RT-PCR 試驗,最低可以檢測到本試驗所抽提核酸10-4稀釋度(見中插彩版圖3),對應的核酸濃度為7.2 ×10-5μg/mL。

圖3 實時熒光RT-PCR 靈敏度檢測結果

2.6 實時熒光RT-PCR 重復性試驗 取10-1～10-3稀釋的共3 個濃度的SVV 核酸模板分別進行批內和批間重復性試驗。根據Ct值計算出批內變異系數(CV)0.93%～ 2.47%,批間變異系數(CV)1.25%～2.76%,表明該方法重復性良好(見表2)。

表2 不同SVV 核酸濃度的重復性試驗

2.7 臨床樣品的檢測 為驗證本研究建立的檢測方法的臨床應用價值,用所建立的實時熒光RT-PCR 法對從華南一些豬場收集和企業或養殖場送檢的病豬內臟(32 份)、水皰液(13 份)、口腔拭子(54)、糞便樣品(17 份)等共計116 份臨床樣品進行檢測,并以SVV 核酸作為陽性對照。檢測結果顯示,7 份臨床樣品出現擴增曲線,其中內臟5 份,水泡液2 份,與普通RT-PCR 法檢測結果一致。

3 討論

SVV 是近年來新發現的病毒之一。雖然現有資料顯示SVV 不具備FMDV 的危害性,大多數成年豬感染后預后良好,未引起嚴重的公共衛生后果和經濟損失。但SVV 感染的臨床癥狀類似于FMDV、SVDV、VSV 等其他幾種水皰性疾病的病毒感染,使得感染豬只的上市存在重大的風險和隱患,也使疫病針對性防控帶來困難。近年來SVV 在巴西、美國和我國幾乎同時發生,說明有進一步擴大和暴發的可能,且局部地區傳播速度快,仔豬致死率較高,其潛在影響是不可估量的,不得不引起足夠的重視。我國現已有4 個省份部分豬場感染SVV 的報道[6-9],尚不知其他地區是否也存在SVV 感染情況,一旦大規模暴發可能會給我國養殖業帶來嚴重的經濟損失。因此,我國農業部制定的《2018 年獸醫工作要點》中就明確提出做好塞內卡病毒病等新傳入疫病的防治工作[14]。另外,我國每年都會進口大量冷凍豬肉,種豬及其遺傳物質(胚胎、精液)進口數量也較大。為防止該病的新病毒株從國外傳入我國,必須盡快研究建立快速檢測和鑒別方法。

本研究針對3D 和VP1 基因片段較保守區,設計并通過大量試驗篩選出特異敏感的普通RT-PCR引物和實時熒光RT-PCR 引物探針,建立了檢測SVV 的普通RT-PCR 和實時熒光RT-PCR 法。試驗過程中考慮到利用體外轉錄的RNA 作為標準品,無法真實反應逆轉錄過程,且制備過程中產生的DNA殘留難以去除,因此本試驗利用滅活病毒作為陽性品可以有效監控病毒核酸檢測的全過程,以確保檢測結果的準確。通過對116 份臨床樣品進行檢測,并以SVV 核酸作為陽性對照,檢測結果顯示7 份臨床樣品出現擴增曲線,與普通RT-PCR 法檢測結果一致。本研究建立的SVV 實時熒光RT-PCR 快速檢測方法具有較高的推廣應用價值,可用于SVV的快速檢測,對塞內卡病毒病的防控具有重要的意義。