楊梅黃酮對環磷酰胺誘導雄性小鼠生精障礙的試驗

(吉林醫藥學院,吉林吉林 132013)

環磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)是周期非特異性抗腫瘤藥,對多發性骨髓瘤、急性淋巴細胞白血病、淋巴瘤[1]、卵巢癌、乳腺癌等有效。在臨床應用中發現其對男性生殖系統有損傷作用并對后代存在潛在致畸風險,常作為少精癥和弱精癥模型的誘導劑,它在殺傷腫瘤細胞的同時,會導致機體生精障礙,是制備生精障礙動物模型的理想藥物[2-3]。楊梅黃酮(Myricetin,M)別名楊梅素,是楊梅科楊梅屬植物楊梅的主要成分。研究顯示,楊梅黃酮具有降糖、抗炎[4]、抗腫瘤[5-6]、抗帕金森病[7]、抗疲勞等多種作用。但楊梅黃酮對環磷酰胺誘導小鼠生殖功能障礙拮抗作用的研究并不多,研究楊梅黃酮改善環磷酰胺化療引起的生殖功能障礙具有重要的理論與實際意義。本試驗通過對環磷酰胺所致生精障礙的雄性小鼠給予不同劑量的楊梅黃酮灌胃30 d,探討楊梅黃酮對雄性小鼠生殖功能的作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康ICR 小鼠,SPF 級,雄性,18～22 g,由長春市億斯實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號SCXK(吉)2016 -0003。

1.1.2 藥品試劑 楊梅黃酮(質量分數98%),批號:WZ16025,西安萬滋生物科技有限公司;環磷酰胺(質量分數≥98%),北京華邁科生物技術有限公司,批號:CO79504;甲睪酮,天津力生制藥股份有限公司,批號:1 602003;乳酸脫氫酶(LDH)、核因子κb(NF-κb)、腫瘤壞死因子α(TNF -α)ELISA 試劑盒,上海恒遠生物科技有限公司,批號:H18Y11;MDA、微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒,南京建成生物工程公司,批號:20 180412;Bradford 蛋白濃度測定試劑盒,上海碧云天試劑公司。

1.3 儀器 SC -3612 低速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;T10 分散機(basic ULTRA -TURRAX),德國IKA 公司;HPX -9272MBE 電熱恒溫培養箱,上海博訊實業有限公司醫療設備廠;722可見分光光度計,上海欣茂儀器有限公司產品;BioTek ELX800 酶標儀,美國博騰儀器有限公司;DP80 型激光共聚焦顯微鏡,日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組和給藥 小鼠72 只,體重18～22 g,隨機分為6 組:對照組、模型組、楊梅黃酮低、中、高劑量組(ML 組、MM 組、MH 組)、甲睪酮組(T組,10 mg/kg·d),每組12 只。除對照組,各組均腹腔注射環磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)50 mg/kg·d,連續7 d,對照組同時給予等體積生理鹽水腹腔注射,楊梅黃酮組及甲睪酮組自造模2 d開始灌胃給藥,楊梅黃酮組給藥劑量為100、200、400 mg/kg·d,每天1 次,連續30 d,對照組和模型組每日灌胃等體積的0.25%羧甲基纖維素鈉溶液。

末次給藥后禁食不禁水24 h,小鼠稱體重(BW)后10%水合氯醛(0.3 mL/kg·bw)麻醉,快速取雙側睪丸和附睪,剝除粘連的血管、韌帶及脂肪等組織,迅速用分析天平稱質量、記錄睪丸濕質量,稱重后留做組織均漿。腹主動脈取血,留血清備用。每組隨機挑取小鼠2 只,頸椎脫臼處死之后取出睪丸,4%多聚甲醛固定24 h,常規石蠟包埋,切片備用,用于H.E.染色。

1.2.2 精子密度檢查(血細胞計數板法) 取雙側附睪迅速置于37.0 ℃2 mL 生理鹽水中,探針充分剝離附睪后,于37.0 ℃恒溫箱中孵育15 min,使精子游出。4 層擦鏡鏡紙過濾,得稀釋的精液。取上述精液100 μL 加3%NaCl 100 μL,混勻后取1 滴滴在蓋玻片的邊緣(血細胞計數板上),精液自行滲入,靜置1～2 min 后,于400 倍光學顯微鏡下按紅細胞計數法計精子數。對于壓線精子的計數是數頭不數尾,數上不數下,數左不數右。

1.2.3 精子畸變試驗 取精液1 滴于載玻片上涂片。自然干燥后,再甲醇固定5 min 以上至干燥。用1%伊紅染色1 h,用水輕沖多余染劑,干燥。置于鏡下統計精子畸變數目,每張片子計數1 000 個精子。為了減少誤差,對同一個樣品應進行2 次精子數量檢查,求其平均數。

1.2.4 血清GSH 含量的檢測 取血清,嚴格按試劑盒說明用酶標儀檢測血清中GSH 含量。

1.2.5 睪丸組織MDA、TNF -α、NF -kb 含量及LDH 活性的測定 取睪丸組織,用生理鹽水在冰浴下制成10% 組織勻漿,4 ℃,4 000 r/min 離心15 min,取上清液嚴格按試劑盒說明書(采用硫代巴比妥酸法)測定MDA 含量,檢測組織蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。取10%小鼠睪丸組織勻漿,嚴格按照試劑盒說明用酶標儀測定TNF -α 及NF -κb 含量。取10%睪丸組織勻漿上清液稀釋為1%,嚴格按照試劑盒說明書測定LDH 水平。

1.2.6 睪丸H.E.染色 將睪丸于4%多聚甲醛固定24 h,常規石蠟包埋,切片備用,用于H.E.染色,光學顯微鏡下觀察,并拍照。

2 結果

2.1 楊梅黃酮對CTX 誘導生精障礙小鼠的精子密度及精子畸變率的影響 結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠精子密度明顯下降、精子畸形率顯著增加(P<0.01),說明CTX 影響小鼠的精子生成過程,精子的形成和成熟受到干擾。各劑量楊梅黃酮、甲睪酮處理后,精子密度增加,且精子畸形率降低,楊梅黃酮中、高劑量組及甲睪酮組與模型組比較具有統計學差異(P<0.05 或P<0.01)。可見楊梅黃酮對CTX 所致雄性小鼠生殖毒性有改善作用,見圖1、圖2。

圖1 楊梅黃酮小鼠精子密度的影響

圖2 楊梅黃酮對小鼠精子畸形率的影響

2.2 楊梅黃酮對CTX 誘導生精障礙的小鼠血清中GSH 及睪丸組織中MDA、LDH 水平的影響 結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠血清中GSH 含量降低、睪丸組織中MDA 含量顯著性增高,睪丸組織中LDH 活性降低(P<0.05 或P<0.01),說明CTX 對小鼠生殖系統引起氧化應激損傷,從而影響了精子生成功能酶的活性,同時可見中、高劑量的楊梅黃酮治療后血清中GSH 含量增高,各劑量的楊梅黃酮治療后睪丸組織MDA 含量降低、LDH 活性增高,與模型組比較有統計學差異(P<0.05 或P<0.01),說明楊梅黃酮有一定的清除氧自由基、抗氧化作用,見圖3、圖4、圖5。

圖3 楊梅黃酮對小鼠血清GSH 含量的影響

圖4 楊梅黃酮對小鼠睪丸組織MDA 含量的影響

圖5 楊梅黃酮對小鼠睪丸組織MDA 含量的影響

2.3 楊梅黃酮對CTX 誘導生精障礙的小鼠睪丸組織中TNF -α 及NF -κB 含量的影響 結果表明,模型組小鼠睪丸組織中TNF -α 及NF -κB 含量高于對照組(P<0.05 或P<0.01);與模型組比較,楊梅黃酮中、高劑量組及甲睪酮組睪丸組織中TNF-α及NF-κB 含量減少,楊梅黃酮中、高劑量組及甲睪酮組與模型組比較具有統計學差異(P<0.05 或P<0.01),見圖6、圖7。

圖6 楊梅黃酮對小鼠睪丸組織TNF-α 含量的影響

圖7 楊梅黃酮對小鼠睪丸組織NF-κB 含量的影響

2.4 楊梅黃酮對CTX 誘導生精障礙的小鼠睪丸組織病理改變的影響 H.E.染色睪丸組織切片:對照組睪丸生精小管排列密集,生精上皮厚,生精細胞層次和數量多,生精小管腔均見精子形成;與對照組比較,模型組睪丸多數生精小管直徑明顯變細,間距較寬,生精上皮明顯變薄,生精細胞層次和數量減少,多數生精小管腔未見精子形成,管腔內可見脫落的生精細胞;與模型組比較,楊梅黃酮給藥組、甲睪酮組生精上皮增厚,生精細胞層次和數量明顯增多,以楊梅黃酮高劑量組尤為明顯(見中插彩版圖8)。

圖8 睪丸組織結構變化 (H.E.染色,100 ×)

3 討論

環磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX) 屬于烷化劑,可以與DNA 形成交聯,抑制DNA 合成,從而抑制細胞增殖而發揮抗腫瘤作用。目前研究認為,環磷酰胺致生精功能損害的機制可能是環磷酰胺經肝微粒體P450 酶系代謝生成有毒的親電子物質如丙烯醛、4 -羥化物和氯乙醛,這些產物導致自由基清除酶活性下降,造成自由基蓄積,影響類固醇激素合成酶的活性,并引起脂質過氧化反應,使細胞膜結構破壞,造成生殖細胞損傷,使精子微環境發生改變。因此尋找與開發可有效地防治氧化應激造成的生殖細胞損傷的天然化合物,延緩生精功能損傷成為共識。楊梅黃酮(Myricetin)是從楊梅科屬植物的葉、皮及根中提取出來的一種黃酮類化合物,臨床上可用于消炎、抗氧化、止痛、降低血糖和保護肝臟等多種治療。由于其豐富的資源優勢和巨大的潛在藥用價值,目前已有多種楊梅黃酮保健品上市。楊梅黃酮屬于多酚類天然化合物,研究表明其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、延緩衰老和保護心血管系統等多種藥理作用。因楊梅黃酮結構中具有多個酚羥基而具有天然抗氧化活性之功效。本課題組研究發現藥物楊梅黃酮在保護生精功能方面也有明顯的效果[8]。目前有關楊梅黃酮在環磷酰胺誘導的小鼠生精障礙的保護作用及機制還未見報道。本試驗采用腹腔注射50 mg/kg·bw 環磷酰胺連續7 d 建立生精障礙動物模型,然后給予楊梅黃酮進行干預和研究。

乳酸脫氫酶(LDH)是生精細胞糖代謝功能的主要酶,LDH 的活性與生精上皮成熟及精子活動、獲能及受精密切相關,是評價生精能力的重要指標[9]。還原型谷胱甘肽(GSH)可以非酶促反應的形式直接與氧自由基結合,達到清除氧自由基的目的,是抗氧化系統中的關鍵成分。脂質過氧化產物丙二醛(MDA)是反映機體內活性氧水平的較好指標,活性氧對生殖細胞引起的氧化應激損傷,破壞精子質膜的流動性,引起睪丸間質細胞受損傷和精子生成異常,從而使生精功能減弱及精子質量下降[10]。研究結果發現給予楊梅黃酮預防治療后,精子密度升高,且精子畸形率降低,睪丸組織中LDH、GSH 水平增高、MDA 含量降低,楊梅黃酮組睪丸組織病理與模型組比較,生精上皮增厚,生精細胞層次和數量明顯增多,由此可見,楊梅黃酮可通過抗氧化作用改善生精功能,對環磷酰胺所致的生精障礙具有防治作用。

氧化應激和炎性反應密切相關,氧化應激可觸發多種調控細胞內炎性因子的信號通路,誘發炎癥反應。腫瘤壞死因子-α(TNF -α)主要由巨噬細胞分泌,作為活性氧(ROS)和活性氮(RNS)生成調節因子,在炎癥反應、免疫反應、平衡細胞存活與細胞凋亡中起著重要作用[11]。核因子(NF -κB)是一種參與免疫反應、炎癥、胚胎發育、組織損傷修復相關的基因表達重要的基因調控因子,正常情況下,NF-κB 以無活性的三聚體形式(p50、p65 及抑制因子IκB)存在細胞質中,當細胞受到TNF -α、IL -1β及內毒素等刺激時,IκB 被降解后NF-κB 與IκB 發生解離而激活,活化的NF -κB 進入細胞核中發揮生物學作用,其會導致多種自身免疫性疾病如類風濕性關節炎[12]、動脈硬化、炎性腸病等。本試驗模型組小鼠睪丸組織中TNF -α 及NF -κb 含量高于對照組,同時楊梅黃酮中、高劑量組睪丸組織中TNF-α及NF -κb 含量減少,與模型組比較具有統計學差異。說明楊梅黃酮具有抗炎作用,楊梅黃酮可能通過抗氧化作用阻止生殖細胞的脂質過氧化,進而發揮抗炎作用,保護活性氧引起的生殖細胞氧化損傷。

綜上所述,楊梅黃酮通過抗氧化及抗炎作用而對環磷酰胺所致的小鼠生精損傷發揮保護作用,其在臨床開發對CTX 化療引起生精障礙具有防治作用的藥物具有一定的理論依據,但有關楊梅黃酮保護生殖功能的具體細胞信號轉導機理還需進一步探討。