高活性纖維素酶食用菌菌種篩選

徐 源，崔繼鵬，武秋穎，范永山

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高活性纖維素酶食用菌菌種篩選

徐 源，崔繼鵬，武秋穎，范永山

（唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

利用剛果紅染色法對(duì)生產(chǎn)中常見(jiàn)的6個(gè)食用菌菌種進(jìn)行高活性纖維素酶菌株篩選，通過(guò)方差分析和α=0.01水平上的DuncanS-N-K均數(shù)間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)雞腿菇的產(chǎn)纖維素酶能力顯著優(yōu)于其他菌種。培養(yǎng)72 h時(shí)的雞腿菇51的纖維素酶活力最高，達(dá)到33 U?μL-1，72 h后產(chǎn)酶能力逐漸下降。

纖維素酶；剛果紅；酶活力；食用菌

食用菌，是一類能形成大型肉質(zhì)（或膠質(zhì)）子實(shí)體或菌核類組織并能供人們食用或藥用的大型真菌。食用菌沒(méi)有葉綠素，依靠降解培養(yǎng)物來(lái)提供自身生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，大型真菌的酶資源異常豐富，依靠它產(chǎn)生的纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶，能分解一般動(dòng)植物不能利用的纖維素，半纖維素和木質(zhì)素[1-3]。食用菌品種眾多，不同品種產(chǎn)酶組分和能力各有不同。因此，篩選產(chǎn)酶能力強(qiáng)的高活性纖維素酶食用菌迫切而重要。

本文以6個(gè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的平菇[4]、雞腿菇[5]和茶樹(shù)菇[6]菌種為試驗(yàn)材料篩選高活性纖維素酶菌種，為進(jìn)一步分離純化高活性纖維素酶及其生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

平菇（平原生3、黑嘉麗、何氏200、繡針菇71）、雞腿菇51和茶樹(shù)菇TS1，均由唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉海英研究員提供。

1.2 培養(yǎng)基制備

PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g、蔗糖20 g、瓊脂18 g、水1 000 mL。自然pH下，121 ℃高壓滅菌30 min。

固體篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 2.0 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂18 g、水1 000 mL。自然pH下，121 ℃高壓滅菌30 min。

液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 2.0 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、水1 000 mL。自然pH下，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.3 菌株活化及培養(yǎng)方法

將保存在PDA試管斜面培養(yǎng)基中的菌種在無(wú)菌環(huán)境下轉(zhuǎn)接至PDA平板培養(yǎng)基中央，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，至菌絲布滿培養(yǎng)皿。用直徑0.8 cm的打孔器沿同一菌落直徑打孔，用接種鏟挑取菌盤，將菌盤轉(zhuǎn)接至固體篩選培養(yǎng)基平板中央，28 ℃倒置培養(yǎng)6-7 d，至菌落直徑達(dá)5 cm左右。再次打菌盤轉(zhuǎn)接至固體篩選培養(yǎng)基平板中央，28 ℃倒置培養(yǎng)3 d，待測(cè)。

將篩選出的菌種，轉(zhuǎn)接至裝有5 mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的15 mL離心管中，每支離心管接3個(gè)菌盤，菌盤直徑0.8 cm，于28 ℃、180 rpm條件下，分別培養(yǎng)72 h、96 h和120 h。

1.4 剛果紅染色法篩選產(chǎn)酶菌株

向待測(cè)平皿內(nèi)加入10 mL 1.5 mg/mL剛果紅染色液，靜置染色20 min，然后用0.9% NaCl溶液沖洗浸泡脫色[7]。選擇透明圈明顯，邊界清晰的平皿，分別測(cè)量透明圈直徑（）和菌落直徑（），以透明圈直徑和菌落直徑的比值（/）大小作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)[8]。

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

1.5 纖維素酶活力檢測(cè)

配制濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別取出0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至6支15 mL具塞試管中，分別加入2.0 mL的DNS試劑搖勻，沸水浴10 min，水浴結(jié)束后立即冷卻，加蒸餾水定容至10 mL。用分光光度計(jì)測(cè)定540 nm處吸光度值，用Excel繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：

= 1.179 3- 0.0.015 5（2= 0.998 4）。

將產(chǎn)酶培養(yǎng)發(fā)酵液于4 ℃，4 000 rpm，離心10 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液1.0 mL，加入1% CMC-Na溶液1.0 mL，50 ℃水浴30 min，然后加入2.0 mL DNS試劑，沸水浴10 min，水浴結(jié)束立即冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，混勻。用沸水浴10 min滅活的粗酶液作對(duì)照，測(cè)定540 nm處吸光度值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖含量，根據(jù)酶活計(jì)算公式計(jì)算酶活。

酶活定義為：1.0 mL酶液、1.0 min催化纖維素生成1.0 μmol葡萄糖為1個(gè)酶活單位，以U?mL-1表示，計(jì)算公式為：

式中，表示粗酶液的稀釋倍數(shù)；5.56為還原糖的摩爾系數(shù)；表示由吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖濃度；表示酶解反應(yīng)之后試管內(nèi)溶液體積；表示反應(yīng)時(shí)間；1表示所加酶液體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 剛果紅染色法篩選試驗(yàn)

將6個(gè)食用菌菌種在產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3 d后，剛果紅染色試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖可見(jiàn)，6個(gè)菌種均產(chǎn)生明顯的淺黃色透明圈，且邊界清晰。

圖1 剛果紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)菌種測(cè)量D/d，結(jié)果如表1所示。對(duì)纖維素降解能力最強(qiáng)的是雞腿菇71，其次為平菇各品種，降解能力最弱的菌種是茶樹(shù)菇TS1。對(duì)初篩的D/d進(jìn)行方差分析和α=0.01水平上的Duncan S-N-K均數(shù)間兩兩比較，結(jié)果表明雞腿菇與其他菌株間差異極其顯著。

表1 剛果紅染色篩選測(cè)定D/d結(jié)果

2.2 纖維素酶活性檢測(cè)

對(duì)雞腿菇51進(jìn)行液體培養(yǎng)，測(cè)定內(nèi)切纖維素酶活力，結(jié)果如圖2所示。

在28 ℃，180 rpm、自然pH值條件下，培養(yǎng)72 h時(shí)，雞腿菇51產(chǎn)纖維素酶活力最高，達(dá)到33 U/μL，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素酶活力逐漸下降。與72h相比，發(fā)酵時(shí)間為96h時(shí)，纖維素酶活性下降了46%，到120h時(shí)，纖維素酶活性下降了79%。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間雞腿菇產(chǎn)纖維素酶活力測(cè)定

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)6種常用的平菇、雞腿菇和茶樹(shù)菇菌種進(jìn)行纖維素活性檢測(cè)和產(chǎn)酶能力分析，發(fā)現(xiàn)雞腿菇51的纖維素活性和產(chǎn)酶能力顯著高于供試的平菇和茶樹(shù)菇菌種。

[1] 黃年來(lái).中國(guó)食用菌百科[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1993: 100-101.

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[3] 趙國(guó)萍,李迎秋.纖維素酶的研究進(jìn)展及其在食品工業(yè)的應(yīng)用[J].山東食品發(fā)酵,2015,45(2):37-40.

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Screening of Edible Mushrooms with High Cellulase Activity

XU Yuan, CUI Ji-peng, WU Qiu-ying, FAN Yong-shan

(Department of Life Science, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, China)

The high-cellulase-activity strains were screened by Congo red staining method from 6 common varieties of edible fungi, and the analysis of variance and the average number of Duncan S-N-K on the level of alpha=0.01 were compared. The results showed that the cellulase-producing ability ofwas significantly better than that of other strains, followed byand. The cellulase activity ofcame to the climax of 33 IU/L after 72 hours of liquid cultivation, then the enzyme production ability gradually decreased with the extension of culture time.

cellulase; Congo red; enzyme activity; edible fungi

S646

A

1009-9115(2019)03-0064-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2019.03.018

唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（17120204a），唐山師范學(xué)院科技發(fā)展項(xiàng)目（2017C03、2016C05）

2018-07-19

2018-12-04

徐源（1994-），女，吉林白山人，本科生，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。

（責(zé)任編輯、校對(duì)：李春香）