前列腺癌組織中miRNA-34c、c-Met mRNA的表達觀察

朱志義，竇中嶺

(1河南科技大學臨床醫學院，河南洛陽 471003；2河南科技大學第一附屬醫院)

前列腺癌是常見的男性泌尿系統惡性腫瘤，發病率居男性惡性腫瘤第一位[1]。2000～2011年，我國前列腺癌發病率及病死率持續增長，2015年我國前列腺癌發病率為60.3/10萬例、病死率26.6/10萬例[2]，嚴重影響男性健康。近年來前列腺癌診斷和治療水平得到極大提高，但確切病因及發病機制尚不清楚，晚期轉移性前列腺癌患者病死率較高[3]。微小RNA(miRNA)是一段內源性、非編碼、18～25個核苷酸的RNA序列，可通過結合mRNA的3′UTR，誘導mRNA降解或抑制mRNA的翻譯發揮作用，影響細胞分化、增殖、侵襲和凋亡等過程。多種miRNA的異常表達與前列腺癌的發生發展相關，miR-34家族包括miR-34a、miR-34b及miR-34c,miR-34c基因位于11q23,其在結腸癌、喉癌等腫瘤組織中miR-34c表達下調[4～7]。編碼受體酪氨酸激酶的肝細胞生長因子受體(c-Met)是較早鑒定的原癌基因，肝細胞生長因子(HGF)是其主要配體，c-Met/HGF在不同組織具有不同的生物學功能，與器官再生、腫瘤形成過程中促進細胞有絲分裂有關[8]。在膠質細胞瘤、黑素瘤、結腸直腸癌、乳腺癌等許多腫瘤組織中均存在c-Met過度表達現象，與腫瘤浸潤、轉移及不良預后有關，抑制c-Met表達是一種新的腫瘤治療方式[9]。近年前列腺癌組織中c-Met表達情況研究結果尚不一致。本研究觀察了前列腺癌組織中miR-34c、c-Met mRNA的表達情況，分析其與前列腺癌臨床病理參數、預后的關系，并探討兩者在前列腺癌發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年9月～2013年9月河南科技大學第一附屬醫院收治的前列腺癌患者63例，年齡55～78(67.54±7.80)歲；術中獲取前列腺癌組織標本，術后均經病理檢查確診。根據Gleason評分系統進行病理分級，參照《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》推薦的標準[10]分組如下：Gleason評分≤6分29例、Gleason評分≥7分34例；參照2002年美國癌癥聯合會前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期27例、Ⅲ～Ⅳ期36例；前列腺癌患者初始血清前列腺特異抗原(PSA)8.3～131 ng/mL,平均35.6 ng/mL，其中≤10 ng/mL者11例、10～20 ng/mL者33例、>20 ng/mL者19例；均檢測血清堿性磷酸酶、X線、MRI、核素骨掃描等檢查后明確遠處轉移14例、無轉移49例。前列腺癌患者術后隨訪2～60個月，平均47.7個月，以門診或電子通訊方式，定期進行直腸指檢、血清PSA、B超及MRI等檢查，隨訪至2018年9月30日或患者死亡。另選同期因前列腺增生接受恥骨上前列腺摘除術的患者45例，年齡58～80(66.57±7.12)歲;術中獲取的組織標本,術后均經病理檢查確診。兩組患者均為初次診斷，術前均未接受其他治療，并排除其他惡性腫瘤。組織經液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存備用。本研究經河南科技大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 組織miR-34c、c-Met mRNA檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。TRIzol法提取細胞中總RNA。以3 μL總RNA為模板，用TaqMan逆轉錄試劑盒在ABI prism 7500熒光定量PCR儀上進行逆轉錄合成cDNA，反應條件：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。miR-34c特異性莖環引物：5′-CGCGAGGCAGTGTAGTTAGCT-3′，5′-AGTGCAGGG-TCCGAGGTATT-3′；內參基因U6:5′-GCTTCGGCAG-CACATATACTAAAAT-3′，:5′-CGCTTCACGAATTTG-CGTGTCAT-3′，c-Met:5′-TGAAATTCATCCAACCAA-ATCTT-3′,5′-AATAGAAAACTGACAATGTTGAGAG-G-3′。實時熒光定量PCR反應總反應體系20 μL中，含1 μL cDNA、1 μL 引物對、8 μL Power SYBR Green Master Mix試劑、10 μL不含RNase去離子純水，反應條件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s,60 ℃、30 s，40個循環。所有反應均在ABI 7500PCR儀上完成，每個樣本重復3次。用2-ΔΔCt表示受檢組織中miRNA-34c、c-Met mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 前列腺癌組織、前列腺增生組織中miR-34c、c-Met mRNA相對表達量比較 前列腺癌組織、前列腺增生組織中miR-34c相對表達量分別為0.521±0.426、1.247±0.681，c-Met mRNA的相對表達量分別為2.527±0.348、1.056±0.217，兩者比較，P均<0.05。前列腺癌組織、前列腺增生組織中miR-34c相對表達量分別為0.521±0.426、1.247±0.681，c-Met mRNA的相對表達量分別為2.527±0.348、1.056±0.217，兩者比較，P均<0.05。

2.2 前列腺癌組織miR-34c、c-Met mRNA表達的相關性 前列腺癌組織miR-34c、c-Met mRNA表達呈負相關(r=-0.630，P=0.002)。

2.3 miR-34c、c-Met mRNA表達與前列腺癌臨床病理參數的關系 結果見表1。

表1 miR-34c、c-Met mRNA表達與前列腺癌臨床病理參數的關系

注：由表1可知miR-34c表達與前列腺癌患者Gleason評分和TNM分期有關(P均<0.05)，c-Met mRNA表達與前列腺癌患者Gleason評分、TNM分期及有無遠處轉移有關(P均<0.05)。

2.4 miR-34c、c-Met mRNA表達與前列腺癌患者預后的關系 以前列腺癌組織中miR-34c、c-Met mRNA相對表達量的中位數為界，分別將63例前列腺癌患者分為miR-34c高表達者33例與miR-34c低表達者30例、c-Met mRNA高表達者35例與c-Met mRNA低表達者28例。miR-34c高表達者3、5年 總體生存率(OS)分別為84.85%(28/33)、60.61%(22/33)，miR-34c低表達者分別為70.00%(21/30)、40.00%(13/30)，分析表明miR-34c高表達者3、5年 OS均顯著高于低表達者(χ2分別為5.387、7.627，P均<0.05)；前列腺癌患者中c-Met mRNA高表達者3、5年 OS分別為68.51%(24/35)、37.14%(13/35)，c-Met mRNA低表達者分別為89.29%(25/28)、78.57%(22/28)，分析表明c-Met mRNA高表達者3、5年 OS顯著低于c-Met mRNA低表達者(χ2分別為5.808、9.807，P均<0.05)。

3 討論

前列腺癌是常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤，近年發病率有逐漸增加的趨勢[1]。近年來隨著分子遺傳學和腫瘤的發生發展機制研究的深入，出現許多新的診斷治療方法及藥物，如基因治療、免疫治療等，改善患者生存質量，延長患者生存時間。但目前對晚期前列腺癌、激素抵抗性前列腺癌等，目前臨床仍無有效的治療方案。因此有必要深入研究前列腺癌的分子機制，尋找新的診斷治療靶點。miRNA廣泛存在于真核細胞中，作為內源性非編碼RNA，其前體在Dicer酶加工后形成具有莖環二級結構，結合于mRNA的3′非編碼區，影響mRNA的穩定性，影響基因的轉錄。目前大量研究表明[5,7]，miRNA通過影響癌基因及抑癌基因的表達，調控腫瘤的發生發展過程，影響腫瘤細胞增殖、凋亡、血管生成、親潤轉移等惡性生物學過程。研究[11]表明，miRNA參與多條細胞信號傳導通路的調節，如TGF-β傳導通路、雄激素受體傳導通路等，與前列腺癌細胞增殖、凋亡、轉移等惡性生物學行為密切相關。在結腸癌、非小細胞肺癌和肝細胞癌等19種腫瘤中均存在miR-34異常表達下調的現象。本研究中，前列腺癌組織中miR-34c的相對表達量明顯低于前列腺增生組織，表明前列腺癌組織中miR-34c表達下調，與以往研究[12]結果一致。其機制可能與miR-34c基因位點11q23雜合性缺失有關，也可能與表觀遺傳學修飾后miR-34c基因失活有關[13]。本研究中Gleason評分≥7分前列腺癌患者癌組織miR-34c表達量低于評分≤6分者，Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌組織miR-34c表達量低于Ⅰ～Ⅱ期者，表明miR-34c的表達與腫瘤較高的TNM分期、病理分級有關。其機制可能是miR-34的表達受轉錄因子p53的調節，p53基因的突變或缺失多發生于高級別、進展期前列腺癌中[14]，p53基因突變導致miR-34表達下降，因而在低級別、早期局限性前列腺癌中miR-34表達下降不明顯。本研究中miR-34c高表達組患者3、5年 OS顯著高于miR-34c低表達者，表明miR-34c高表達者患者與miR-34c低表達者患者相比預后較好，可能與miR-34c的抑癌作用有關。

c-Met是一種原癌基因，位于7q31上，其能編碼190 KD的跨膜糖蛋白，近年研究[15]發現，發現前列腺癌組織c-Met mRNA高表達與高Gleason評分密切相關。本研究結果表明，前列腺癌組織中c-Met的表達量明顯高于前列腺增生組織，表明前列腺癌組織中c-Met mRNA表達上調，其機制可能與c-Met原癌基因擴增有關，也可能與缺氧導致HIF1α升高，進而誘導c-Met基因表達增加有關[16]。本研究中Gleason評分≥7分前列腺癌患者癌組織c-Met表達量高于評分≤6分者，Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌組織c-Met mRNA表達量高于Ⅰ～Ⅱ期者，有遠處轉移前列腺癌患者癌組織c-Met mRNA表達顯著高于無遠處轉移者，表明c-Met mRNA表達與腫瘤較高的分期及病理分級有關，并且與腫瘤遠處轉移有關。其機制可能與前列腺癌細胞c-Met/HGF過度活化后，激活PI3K/ERK通路，下調E-鈣黏素表達，并誘導細胞發生上皮間質轉化，使腫瘤細胞獲得局部浸潤和遠處轉移的能力[17]。本研究中c-Met高表達者3、5年 OS顯著低于c-Met低表達者，表明c-Met高表達提示患者的不良預后，可能與c-Met高表達患者分期、分級較高有關。

有研究[18]表明鼻咽癌、胃腸癌、肺癌中miR-34c能夠下調c-Met基因表達，進而影響腫瘤細胞增殖、侵襲轉移及凋亡。本研究中，對前列腺癌組織中miR-34c與c-Met mRNA表達的相關性進行分析，結果表明二者呈負相關，提示二者可相互作用，共同促進前列腺癌的發生發展。其相互作用的機制可能是c-Met表達活化PI3K/AKT/mTOR通路，mdm2表達增加進而抑制p53蛋白功能[19，20]，p53基因激活促進miR-34c表達，miR-34c進而靶向抑制c-Met基因表達，從而形成一條反饋環路。