芹菜籽提取物灌胃對大鼠慢性高原病的治療作用

周彬，武貴臻，迪麗努爾·買買提依明，楊濤，木尼熱·艾合買提，艾尼娃爾·艾克木

(1新疆醫科大學，烏魯木齊 830011；2新疆醫科大學第一附屬醫院)

高原低氧環境主要表現為低壓低氧、氣候多變、太陽照射強等，其中低氧造成的損傷對機體健康有顯著的影響[1]。如機體長時間暴露于高原低氧環境，會發生低氧失代償，從而引發高原肺動脈高壓等慢性高原病(CMS)[2]。肺血管收縮反應的持續增強會導致慢性缺氧誘導的肺動脈高壓和小肺動脈的結構重塑，肺動脈高壓狀態持續會累及心臟，從而發展為右心室肥厚，嚴重導致心力衰竭，危及生命[3]。芹菜，屬傘形科植物，芹菜籽是芹菜的種子，含多種生理學活性的物質，主要包括揮發油化合物、不飽和脂肪酸、黃酮類物質、丁基苯酞類、氨基酸、膳食纖維、香豆素及其衍生物等，具有降血壓、降血脂的生理功能[4,5]。新疆少數民族醫學中以芹菜籽入藥，認為其性干熱，具有健腦安神、活血、祛風除濕的功效，是多種護肝減壓的傳統藥方中的主藥[6,7]。課題組對芹菜籽分別用乙醇和水進行提取，醇提物中高脂溶性成分水平較高，含有豐富的苷原，水提物含有極性較大的化學成分及豐富的糖苷成分。本研究通過建立大鼠CMS模型，并用芹菜籽不同提取物進行干預，通過觀察大鼠肺動脈壓(PAP)及血清CRP、VEGF、EPO、Apo-A1和心臟組織形態學，探討芹菜籽提取物對大鼠CMS是否具有治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、試劑及儀器 健康SD大鼠50只，體質量160～200 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SYXKI(新)2016-0003]；芹菜籽(新疆和田麥迪森有限公司，批號：C41097804)，硝苯地平(山西云鵬制藥有限公司，批號：F160601)；CRP試劑盒(艾博抗上海貿易有限公司，批號：GR3184775-11)，VEGF試劑盒(安徽巧伊生物科技有限公司，批號：201807)，EPO試劑盒(AndyGene，批號：AD20180708)，水合氯醛(分析純，天津市光復精細化工研究所)；Thermo Fisher全波長酶標儀(儀器型號：Multiskan Go，芬蘭)，光學顯微鏡(儀器型號：DM3000 LED，德國)，紫外可見分光光度計(儀器型號：752，中國上海)，微量高速離心機(儀器型號：3-30K；德國)。

1.2 實驗動物分組、CMS模型制備及芹菜籽提取物灌胃 將50只SD大鼠隨機分為A、B、C、D、E組各10只，其中A、B、C、D組大鼠在CMS模型條件下[在西北地區平時和戰時衛勤保障人工試驗艙(位于蘭州軍區新疆烏魯木齊醫院)進行實驗，模擬海拔為5 000 m，氧分壓為10.84 kP，氣壓為54.1 kP，溫度18～26 ℃，濕度40%～60%。實驗過程中每天按時觀察大鼠的飲用水、飼料、毛發、糞便、尿液，行為、自主活動、眼、耳、鼻、口有無分泌物以及定時稱體質量]喂養30 d，本次制模成模率為100%(PAP>30 mmHg)，制模成功后A組灌胃芹菜籽醇提物270 mg/kg，B組給予芹菜籽水提物270 mg/kg，C組給予硝苯地平片2.7 mg/kg，D組給予純凈水，1次/d，共15 d。剩余10只在平原條件下喂養30 d，后灌胃純凈水，1次/d，共15 d。

1.3 大鼠PAP記錄 所有實驗大鼠末次給藥24 h后腹腔注射10%水合氯醛(2.5 mL/kg)麻醉，固定于實驗臺，切開頸部及胸部皮膚，于胸骨正中線打開胸腔，暴露肺和心臟，插管由頸外靜脈插入，從右側頸外靜脈插管到達右心房，進入右心室，再進入肺動脈，出現PAP波形，針頭的另一端和壓力換能器連接。將壓力變化的數據用生物信號記錄儀記錄。

1.4 大鼠血清CRP、EPO、VEGF、APO-A1檢測 所有實驗大鼠完成PAP檢測后，腹主動脈采血，室溫下靜置30 min，以3 000 r/min速度低溫離心20 min，保留上清液，采用購買的試劑盒，按照試劑盒說明書采用ELISA法檢測CRP、EPO、VEGF、APO-A1，結果以OD值表示。

1.5 大鼠心臟組織形態學觀察 所有實驗大鼠在腹主動脈采血后處死，實驗大鼠心臟組織保持原形條件下切塊，用HE染色，中性樹膠封固后，采用光學顯微鏡觀察細胞和組織形態結果變化。

2 結果

2.1 各組大鼠PAP比較 A、B、C、D、E組PAP分別為(37.31±0.83)、(31.28±1.39)、(28.37±1.38)、(44.31±2.04)、(20.74±1.10)mmHg，兩兩比較，P均<0.05。

2.2 各組大鼠血清CRP、EPO、VEGF、Apo-A1水平比較 大鼠血清CRP、EPO、VEGF、Apo-A1水平比較結果見表1。

表1 各組大鼠血清CRP、EPO、VEGF、Apo-A1水平比較

注：與E組比較，*P<0.05；與D組比較，▲P<0.05；與C組比較，#P<0.05；與A組比較，&P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌組織形態學比較 A組：低倍鏡下可見大鼠心臟組織心肌間質血管明顯擴張充血；高倍鏡下偶見心肌間質少量嗜酸性病變細胞浸潤，胞質呈顆粒樣變。B組：低倍鏡下可見大鼠心臟組織大鼠心肌部分血管輕微擴張充血，橫紋不清；高倍鏡下心肌纖維輕微腫脹，心肌間質有少量炎癥細胞浸潤。C組：低倍鏡下可見大鼠心臟組織心外膜較薄，心肌纖維排列輕微程度紊亂；高倍鏡下可見少量心肌細胞嗜酸性變性，心肌細胞輕微程度的顆粒樣變，部分心肌間質血管輕度擴張和充血，無明顯炎細胞浸潤。D組：低倍鏡下可見大鼠心臟組織心外膜下大量出血，心臟纖維排列紊亂，橫紋不清；高倍顯微鏡下心肌纖維化嗜酸性病變細胞浸潤，心肌細胞顆粒樣變性，心肌間質血管明顯擴張和充血，偶見部分間質血管炎細胞浸潤。E組：大鼠心臟組織心外膜下未見明顯滲出物附著，未見明顯心肌增厚；心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，未見壞死、變形、腫脹、嗜酸性病變細胞浸潤等改變；心肌細胞染色清晰，心肌間質無明顯病理改變。

3 討論

長期受到低大氣壓及氧分壓的影響，會引起多器官組織由于缺氧產生的病變，長時間得不到有效控制可引起高原心臟病、高原性肺水腫、腦水腫等疾病；持續性低壓缺氧環境導致肺血管發生重建、肺血管壁增厚、管腔狹窄，從而導致PAP升高，促進右心后負荷增加、右心肥大，最終導致CMS的發生[8]。CMS常表現為紅細胞過度增多、血紅蛋白水平升高、血細胞比容增加，伴有常見的高原反應癥狀，胸悶、氣短、心悸、頭痛，以及腦部功能異常如記憶力減退、失眠等，部分患者伴有血壓異常、肺動脈高壓，面部、手指出現局部發紺，眼結膜血管擴張。以往CMS治療方法主要有以下幾種，物理方法包括靜脈放血療法、高壓氧艙治療，化學方法包括治療性單采紅細胞術、血液等體積稀釋療法，中藥治療包括黨參、紅景天、肉蓯蓉、人參，西藥治療包括內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑、磷酸二酯酶選擇性抑制劑、鈣拮抗劑、前列環素、抗凝藥、擴血管藥物、乙酰唑胺、吸入型一氧化氮等，其治療原則主要為降低PAP，提高機體攜氧量，降低機體需氧量，改善低氧狀態，并針對性的治療并發癥。硝苯地平是鈣拮抗劑的代表藥物，被廣泛應用于CMS的治療，主要用于肺動脈高壓的治療，肺血管收縮是肺動脈高壓的主要因素，其機制是在高原缺氧過程中，阻力血管Ca2+通道表達上調，Ca2+濃度升高啟動各種核轉錄因子，使得肺動脈平滑肌細胞增生，肺動脈壁變厚，管腔減小，循環阻力增加，引起肺動脈高壓[9]。硝苯地平可通過拮抗Ca2+通道以達到減緩肺動脈高壓，緩解CMS癥狀的目的。但長期服用硝苯地平會導致患者出啊先頭暈、惡心、一過性低血壓、腹瀉、胃痙攣、白細胞減少、紫癜、心肌梗死、充血性心力衰竭、肺水腫心律失常和傳導阻滯等。雖然硝苯地平療效確切，但存在不良反應等缺點。

芹菜籽被少數民族用于治療高血壓腦缺血等疾病，芹菜籽中除了含有營養元素外，還含有多種具有生理學活性的物質，主要包括揮發油化合物、不飽和脂肪酸、黃酮類物質、丁基苯酞類、氨基酸、膳食纖維、香豆素及其衍生物等；其藥理作用主要有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓等；課題組對芹菜籽分別用乙醇和水進行提取，擬通過不同的提取溶劑分別獲得芹菜籽中的脂溶性和水溶性化學成分，以及化學成分的苷與苷原，分別研究其對CMS模型大鼠的作用，以確定其有效成分的作用及其有效的提取方式，為今后進一步研究奠定基礎。

PAP升高，促進右心后負荷增加、右心肥大，最終導致CMS的發生。本研究顯示，A、B、C組PAP降低，結果提示兩種芹菜籽提取物均能通過降低PAP，減低右心室后負荷，延緩右心室肥大心肌重構的發生，且水提物的效果優于醇提物。國外研究表明，高原低氧誘發心肌重構，其組織形態變化主要表現為心臟纖維排列紊亂，橫紋不清，纖維化細胞浸潤，間質血管明顯擴張和充血，炎細胞浸潤等[10,11]。本文結果顯示，D組大鼠心外膜下大量出血，心臟纖維排列紊亂，橫紋不清，心肌纖維化嗜酸性病變細胞浸潤，心肌細胞顆粒樣變性，心肌間質血管明顯擴張和充血，偶見部分間質血管炎細胞浸潤；在給予藥物干預后，A、B、C組大鼠心臟組織形態發生變化，提示三種藥物均能延緩高原低氧誘發的心肌重構。

血清CRP水平可以評估炎癥和組織損傷程度，可作為反映心血管疾病的獨立危險因素[12,13]。Verma等[14]發現，CRP可以促進內皮細胞活化，加重功能障礙，誘導了細胞凋亡蛋白介導的冠狀動脈血管平滑肌凋亡，從而加重心肌不良事件的發生。本研究顯示，與D組比較，A、B、C組血清CRP水平均降低，提示三種藥物保護了心肌，且減輕了心肌不良事件的發生，醇提物效果最優，水提物次之。EPO與EPO受體(EPOR)結合，促進造血功能，紅細胞生成增加后，增加血液的運氧能力，從而改善心肌的缺血、缺氧狀態，EPO激活內皮細胞型一氧化氮合酶，誘導一氧化氮合成增加，一氧化氮具有血管擴張功能，增加心肌血液供應，EPO與EPOR結合具有促進新生血管形成的作用，在心肌組織中EPO具有與VEGF相同的促毛細血管生長的作用[15]。本文結果顯示，與D組比較，A、B、C組血清EPO水平降低，說明給于藥物干預后CMS模型大鼠的心肌缺氧狀態得到了明顯的改善，芹菜籽醇提物與硝苯地平的效果相近優于芹菜籽水提物。研究[16]證明，VEGF能促進內皮細胞增生，誘發新血管生成。因此，高原缺氧導致的大鼠心肌組織損傷能刺激VEGF分泌，導致新血管生成，呈現心肌纖維增生，心肌間質血管擴張充血等組織形態學變化。本研究顯示，與D組比較，A、B、C組血清VEGF值均有不同程度降低，說明藥物干預后大鼠心肌纖維增生及心肌間質血管擴張充血得到改善，且芹菜籽兩種提取物效果均優于硝苯地平。Apo-A1具有抗炎和抗氧化作用[17]，在炎癥反應過程中Apo-A1的水平與IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥細胞因子的分泌水平負相關，Apo-A1水平降低進一步導致上述細胞因子的釋放失控，最終引發多器官功能障礙綜合征[18]。本文結果顯示，A、B、C組血清Apo-A1水平升高，說明機體抗炎抗氧化能力明顯升高，醇提物效果最優，硝苯地平次之。

總之，芹菜籽兩種提取物均具有降低CMS模型大鼠PAP，改善其心肌功能，改善及恢復心肌損傷的作用，對CMS模型大鼠的心臟具有保護作用，血清指標顯示醇提物的效果略優于水提物，PAP數據提示水提物降低PAP的效果優于醇提物。通過課題組前期研究及查閱文獻，芹菜籽中含有豐富的黃酮類成分[19]，其所含的黃酮類成分具有降壓、降脂、抗氧化、調節心血管功能等作用[20]，兩種提取物在藥效上存在一定差異，主要是其化學成分組成不同，水提物中黃酮苷及水溶性化合物水平較多，醇提物中苷原及高脂溶性化合物水平較高，課題組將進一步研究其化學成分與藥理作用的相關性，更好的發掘芹菜籽的藥用價值。