維生素D受體基因遺傳變異對慢性變應性鼻炎的預警作用

陳賽明，周小柳，周利民，李志路，張云霞

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)又稱為過敏性鼻炎，表現為致敏個體再次接觸變應原后，變應原與機體內炎性細胞表面的特異性IgE結合，導致機體出現鼻塞、流涕、噴嚏等一系列癥狀的慢性非感染性炎性反應[1]，表現為免疫性疾病的特點。而近些年來，維生素D在免疫性疾病中的調節作用日益受到重視，比如血清中維生素D的水平與AR的發生存在相關性[2]。維生素D受體(vitaminD receptor,VDR)是維生素D的活性形式發揮信號傳導作用的關鍵成分，其結構及活性的改變都可能成為影響維生素D功能的重要因素[3]。近年研究表明，人群中基因多態性形式是形成個體差異和疾病發生的分子基礎，可成為疾病發生和預警的標記[4]。VDR基因存在眾多單核苷酸多態性(single nuclear polymorphism,SNP)位點，而關于其遺傳多態性與AR的關聯性研究較少。因此，筆者選擇了VDR 5個SNP位點rs7975232、rs2228570、rs731236、rs1544410及rs11568820進行病例對照研究，以期探尋上述SNP位點與AR的相關性及預警價值。由于基因分型的方法不同，此文僅報道rs731236、rs1544410及rs11568820三個位點的研究結果。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月—12月海南醫學院第一附屬醫院收治的94例變應性鼻炎患者作為試驗組(AR組)，選擇同期在醫院健康體檢的健康人113例作為健康對照組(HC組)。AR組男53例，女41例，年齡30～52(42.13±7.02)歲；健康對照組男70例，女43例，年齡30～50(41.25±6.88)歲。2組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經醫院倫理委員會批準，入選者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 納入標準：(1)所有AR患者均符合診斷標準[5]；(2)入選者近期未接受糖皮質激素、抗組胺藥等藥物治療。排除標準：(1)變態反應性疾病史者；(2)血液病者；(3)寄生蟲病史者；(4)合并哮喘、特應性皮炎等變應性疾病者；(5)自身免疫性疾病者。

1.3 基因分型方法 采集所有入選者EDTAK2抗凝血2 ml，取200 μl進行基因組DNA提取及質量鑒定。委托上海捷瑞生物工程有限公司對樣本進行VDR基因多態性位點的分型。具體過程如下：合成引物P1(5′-GGTGGGATTGAGCAGTGA-3′)、P2(5′-TCTTGGCATAGAGCAGGTG-3′)進行PCR擴增包含rs731236的193bp的PCR片段；合成引物P3(5′-GTGTGCAGGCGATTCGTAGG-3′)、P4(5′-GGAAGAGGTCAAGGGTCACTG-3′)進行PCR擴增包含rs1544410的185bp的片段；合成引物P5(5′-GAGGGAGGGAGGAAGGAA-3′)、P6(5′-CTGTAGCAATGAAAGCAAACCA-3′)進行PCR擴增包含rs11568820的199bp的片段。純化后分別對上述PCR產物進行延伸，延伸產物各取10 μl，利用美國ABI公司的3730XL基因測序儀進行序列測定及數據讀取。

1.4 統計學方法 利用SNPStats軟件進行分析，連鎖不平衡分析采用Hardy-Weinberg模型，基因型分布頻率采用Logistic 回歸分析，基因型的組間差異用共顯性、顯性、隱性模型3個模型驗證。利用SPSS 25.0軟件對等位基因的分布頻率進行χ2分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VDR基因3個SNP的基本信息 本研究選取3個SNP位點作為研究對象，根據NCBI(SNP)數據庫中的信息，rs731236位于編碼區內，存在T/C兩種形態，其中T為野生型等位基因，全球發生頻率為0.720，突變基因型C屬于次要等位基因，全球發生頻率為0.280；rs1544410和rs11568820屬于內含子突變，均存在G/A兩種多態性，前者野生型等位基因為G，全球發生頻率為0.700，后者野生型等位基因為A，全球發生頻率為0.543；在NCBI數據庫給出的信息中，rs731236突變可能存在臨床意義，而其他兩個SNP位點的突變則未發現，見表1。

表1 VDR基因3個SNP位點的基本信息

注：本表信息提取于2018年10月18日NCBI(SNP)數據庫

2.2 VDR基因3個SNP的基因型檢測及與AR相關性分析 rs11568820在受試人群中均檢測出GG、AG、AA 3種基因型,在AR組和對照組中的分布頻率分別為29.8%/34.5%、51.1%/51.3%、19.1%/14.2%，SNPState在線分析結果顯示共顯性模型、顯性模型、隱性模型的檢測結果差異均無統計學意義(P>0.05)。rs731236和rs1544410在受試人群中均檢測出野生型純合子和雜合子2種基因型，rs731236野生型純合子TT和雜合子CT在試驗組和對照組中的分布頻率分別為87.2%/90.3%、12.8%/9.7%,AR組中雜合子的發生頻率高于對照組，說明突變可能與AR相關，但差異無統計學意義(P>0.05)；rs1544410的野生型純合子GG和雜合子AG在AR組和對照組中的發生頻率分別為90.4%/90.3%、9.6%/9.7%，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 3個SNP位點等位基因發生頻率及與AR相關性分析 rs11568820位點突變等位基因A在AR組中的分布頻率高于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。rs731236、rs154410兩個多態性位點的等位基因分布頻率組間比較差異亦無統計學意義(P>0.05)，見表3。

3 討 論

AR屬于多基因遺傳變態反應性疾病，并以嗜酸性粒細胞趨化、轉移并聚集于鼻黏膜組織為主要病理學特征，同時可釋放大量炎性介質進而加重鼻黏膜損傷[6]。研究表明，許多參與細胞增殖分化及凋亡的信號通路與AR的發生密切相關，例如Notch信號通路、維生素D信號通路，均可通過影響免疫細胞的生命活動而對鼻炎的發生發展產生密切調節和影響[7-8]。維生素D信號通路的主要成分包括維生素D結合蛋白(GC)、細胞色素P450家族成員(CYP2R1)、維生素D受體等。維生素D代謝通路除了影響鈣磷代謝之外，還參與多種疾病的發生發展過程。喬俊英等[9]研究發現，適量1,25-(OH)2D3可能通過調控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在哮喘發病中起重要作用。桂明才等[10]則認為維生素D3可通過調控PI3K/AKT信號通路誘導喉癌細胞凋亡。

表3 維生素D受體3個SNP位點等位基因分布頻率與AR關聯性分析 [基因數(%)]

維生素D受體作為維生素D信號通路中的關鍵成分，其結構與功能對維生素D的代謝及功能發揮起著至關重要的作用。尤其是關于VDR基因多態性與疾病發生的相關性研究越來越多，有研究表明VDR受體基因多態性與北京地區老年男性原發性高血壓的發生密切相關[11]，陳詠等[12]研究發現VDR多態性與多囊卵巢綜合征的發生存在關聯，王麗等[13]則研究了VDR受體基因多態性與鼻咽癌的關聯性。

在本研究中，選擇了2017年在醫院住院治療的AR患者及健康對照者進行對照研究，多態性位點rs11568820檢測出野生型純合子、雜合子、突變型純合子3種基因型，而所選擇的其他2個位點rs731236、rs1544410 則只檢測出野生型純合子及雜合子2種基因型。對rs11568820的3種基因型進行遺傳學模型統計分析，結果表明共顯性模型、顯性模型、隱性模型組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。對rs731236、rs1544410這2個位點進行統計學分析，結果表明差異亦無統計學意義(P>0.05)。此外，對AR組和健康對照組3個多態性位點的等位基因分布頻率進行了分析，結果差異亦無統計學意義(P>0.05)。

表2 VDR基因多態性與AR的關聯性分析 [例(%)]

rs11568820位于12號染色體(47908762)，該區域屬于VDR基因的啟動子區。NCBI數據庫中有超過80條文獻對該位點與血清維生素D的水平及疾病的關聯性進行了研究。Yin 等[14]研究發現此SNP位點與中國人群的胃癌發生存在關聯，Yang等[15]則發現該位點與中國華北地區人群的食管癌有關。這說明rs11568820可能通過影響VDR的表達而影響維生素D信號通路的作用。本研究首次報道了rs11568820與變應性鼻炎的關聯性，結果表明,3種基因型在2組中的分布頻率并未呈現統計學差異，提示該位點的多態性與慢性變應性鼻炎的關聯性不強。

rs731236屬于VDR編碼區密碼子的同義突變，目前NCBI的數據庫中有超過200條文獻報道了該位點與機體性狀及疾病的關聯性。rs1544410屬于VDR編碼基因的內含子突變。Tian等[16]在2015年報道了關于上述2個SNP位點與中國人群AR的關聯性研究，未發現顯著關聯性。本次針對rs731236及rs1544410的研究也未發現與AR的關聯性，這與Tian等的研究結果一致，同時也提示rs731236堿基的形態變化未影響密碼子的功能及蛋白質的結構，而內含子突變rs1544410也未對VDR的表達產生影響。

綜上，本研究的3個多態性位點在慢性變應性鼻炎患者及健康對照者之間的基因型分布頻率、等位基因分布頻率均不存在統計學差異，說明這些位點不是慢性變應性鼻炎的易感位點。因而，在后續的研究中，一方面建議增加研究對象的數量，另一方面建議選取更多的SNP位點進行研究，以期尋找AR的易感SNP位點，從而為其診斷及預警機制的構建提供依據。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

陳賽明：設計研究方案，監督實施過程，論文撰寫；周小柳、周利民：實施研究過程，資料搜集整理；李志路：進行統計學分析；張云霞：提出研究思路，分析試驗數據，論文修改、審核