響應面法優化雞α干擾素工程菌發酵培養基

陳 瓊， 曹 丁， 昝繼清， 李學優， 秦 鵬， 黃秀敏， 張宜靖

（廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663）

畢赤酵母表達系統是一類較早被人類成功改造、高效表達外源蛋白的系統，利用該系統表達外源基因具有良好的應用前景，是實現外源蛋白大規模生產進而推動其實現商品化的重要方法（Yu等，2018）。干擾素（IFN）是一類能誘導人及動物細胞產生多種廣譜抗病毒蛋白的類激素蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等功能。目前禽類干擾素發展滯后于哺乳動物干擾素，存在著生產成本過高，表達效價低，養殖業對其用量大，難以實現規模化生產等問題（王秀麗等，2017）。

本研究前期已構建并篩選出雞α干擾素表達量高的畢赤酵母重組菌株，為改進干擾素生產工藝，解決搖瓶配方成本高、效價低的問題，本研究采用單因素試驗和響應面法對畢赤酵母重組菌在搖瓶水平發酵培養基進行優化，以期獲得低成本高表達量的發酵工藝條件，加快雞α干擾素規?；a的步伐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 重組畢赤酵母：廣東省微生物種質資源庫保存提供；酵母提取物、胰蛋白胨（進口）：OXOID公司；玉米漿干粉：山東康源生物科技有限公司；酵母基礎氮源培養基（YNB）：上海生工生物股份有限公司；PTM1鹽：上海瑞楚生物科技有限公司；葡萄糖、K2SO4、MgSO4等試劑均為國產分析純。752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SMART顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限責任公司；LRH-250生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制 YPD培養基：1%酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖。發酵培養基：3%葡萄糖、1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.8%K2SO4、1.5%MgSO4、0.1%CaSO4、0.5%KH2PO4、0.15%KOH、pH 6.0、PTM1 鹽 4.4 mL/L。

1.2.2 菌種搖瓶培養 將畢赤酵母從初始培養基平板接種至50 mL YPD搖瓶，30℃、180 r/min培養24 h。從YPD搖瓶以2%的接種量接至發酵培養基，于30℃、180 r/min培養48 h，取適量發酵液測定濕重。

1.2.3 培養基成分優化

1.2.3.1 不同碳源對畢赤酵母濕重的影響 將初始培養基中的碳源分別替換為甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜和乳糖（濃度均為3%），設置不加碳源為對照組，其他成分不變。在相同培養條件下搖瓶發酵，測定菌體濕重。

1.2.3.2 不同氮源對畢赤酵母濕重的影響 根據碳源篩選試驗的結果，選取甘油作為碳源進行氮源優化試驗。將初始培養基中的氮源分別替換為玉米漿干粉、YNB、NH4H2PO4、酵母提取物、蛋白胨、（NH4）2SO4和 NH4Cl（濃度均為 3%），設置不加氮源為對照組，其他成分不變。在相同培養條件下搖瓶發酵，測定菌體濕重。

1.2.4 Plackett-Burman試驗設計 Plackett-Burman設計是通過對可能影響響應值的每個因子取高低兩個水平來進行分析，通過比較各個因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性。利用Minitab軟件，對發酵培養基的8個因素進行Plackett-Burman組合設計，各個因素及水平如表1所示，其中“-”和“+”分別表示因素的低水平和高水平（胡瑞萍等，2018）。以菌體濕重（Y）作為試驗的響應值，共進行12組試驗，考察各個因素的主效應和交互效應的一級作用，從中篩選出對菌體濕重具有顯著作用的3個因素。

表1 Plackett-Burman設計各因素及其水平

1.2.5 最陡爬坡試驗 響應面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，在其他區域擬合方程與被近似的函數方程毫無相似之處，幾乎無意義。因此，要先逼近最佳值區域后才能建立有效的響應面擬合方程。因此通過最陡爬坡法以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據Plackett-Burman試驗結果中顯著因素效應值的大小確定變化步長，確定響應面的中心點和最大值范圍（姚兵莉等，2018）。

1.2.6 Box-Behnken響應面優化 根據上述最陡爬坡試驗結果，3個因素的水平已在最優點附近，可以此濃度為中心點采用Box-Behnken響應面試驗建立模型，選取3個因素，如表2所示。將因素對響應值的關系通過擬合二次方程，來對發酵培養基作進一步的優化，以尋求最優值。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對畢赤酵母濕重的影響 由表3可知，培養基中未添加碳源，嚴重影響畢赤酵母的發酵水平。當添加不同碳源時，畢赤酵母濕重均有一定程度的提高，最佳碳源為甘油，此時菌體濕重最高達到81.5 g/L；其次是糖蜜，葡萄糖。

表2 Box-behnken試驗設計各因素水平及其編碼值

表3 不同碳源對畢赤酵母濕重的影響

2.2 不同氮源對畢赤酵母濕重的影響 表4的結果顯示，蛋白胨和NH4H2PO4生物量比較接近，但有機氮源成本相對較高，且不利于后期純化，因此選擇NH4H2PO4作為氮源進行下一步試驗。

表4 不同氮源對畢赤酵母濕重的影響

2.3 Plackett-Burman試驗結果與分析 Plackett-Burman試驗由軟件Minitab設計，共8個因素1個虛擬變量12次試驗。各因素對菌體濕重的具體影響依然采用Minitab軟件進行分析，對顯著性水平大于95%作為重要因素。

由表5、表6和表7結果分析可得：在α=0.05水平上，甘油含量對響應值影響較大，且效應能力由強到弱排序分別為甘油、NH4H2PO4、初始pH、CaSO4。初始pH、甘油含量對生物量具有正促進作用，需適當增加，NH4H2PO4對生物量具有負促進效果，應適當減少，可使生物量增加。R-Sq=99.48%＞75%，說明該模型線性關系良好，回歸顯著，符合實際，是可信的。

2.4 最陡爬坡試驗結果與分析 最陡爬坡試驗設計及結果見表8。隨著甘油、NH4H2PO4和初始pH的變化，五組不同配方培養基中菌體濕重先升高后降低。在甘油濃度4.4%、NH4H2PO4濃度1.6%、初始pH 7.0時，菌體濕重達到最大值為162.9 g/L，以此作為后續試驗中心點進行響應面分析。

2.5 響應面試驗結果與分析 根據Boxbehnken試驗結果 （表9），利用軟件Design Ex-pert對其進行回歸分析，其回歸方程為：Y=161.30-0.1125X1-1.35X2-2.6125X3-5.825X1X2+1.05X1X3+2.275X2X3+6.15X12+0.675X22-10.5X32。經過軟件分析，經F值檢驗，檢驗P值越小，則變量的顯著性越高。由表10可知，該回歸模型（P＜ 0.0001）極顯著，模型失擬項（P=0.2754）為不顯著，說明本模型的整個回歸區域擬合較好。模型的相關系數R2=0.9961，校正系數RAdj2=0.9481，表明該回歸方程能很好的模擬預測真實的響應值。該方程中 X2、X3、X1X2、X2X3、X12、X32（P ≤ 0.01）對濕重影響為極顯著；X1X3（0.01＜P ≤ 0.05）對濕重影響為顯著。

表5 Plackett-Burman試驗設計及結果

表6 Plackett-Burman試驗各因素對響應值的估計效應及系數

表7 生物量（g/L)的方差分析

表8 最陡爬坡試驗設計及菌體濕重

表9 Box-Behnken試驗設計及結果

表10 響應面回歸方程的顯著性及方差分析

利用軟件Design Expert考察各因素及其相互作用對酵母濕重的影響，保持其他因素不變，獲得任意兩個因素及其相互作用對濕重的響應曲面圖。由圖1、2、3可判斷，等高線為橢圓狀，各因素之間具有明顯的交互作用，響應面弧度不明顯，說明范圍選擇較?。ǜ氏槲涞?，2018）。

圖1 甘油與pH交互影響

圖2 磷酸二氫銨與pH交互影響

根據軟件，進行最高濕重預測，當X1為1，X2為-1，X3為-0.182， 即甘油濃度為 46 g/L，NH4H2PO4為 14 g/L，初始 pH為 6.96時，酵母濕重達到最高值，為175.54 g/L。

3 結論

圖3 磷酸二氫銨與甘油交互影響

本文采用響應面法優化高產雞α干擾素畢赤酵母重組菌發酵培養基，通過碳源、氮源的篩選，Plackett-Burman試驗，最陡爬坡試驗綜合響應面建模，確定最佳培養基配方為：甘油 46 g/L，NH4H2PO414 g/L，K2SO418 g/L，MgSO415 g/L，Ca-SO41.0 g/L，KH2PO45 g/L，KOH 1.5 g/L， 初始 pH 6.96，PTM1鹽4.4 mL/L。在此條件下，畢赤酵母發酵濕重為175.54 g/L，生物量比優化前提高了50%，并且培養基組分成本低廉，成分簡單，方便調控和后期分離純化，適合大規模發酵生產。