牦牛血發酵的最佳菌種組合及最優發酵條件探究

陳宇星，鄭玉才，談永萍，饒開晴

（西南民族大學 生命科學與技術學院，四川成都 610041）

目前，國內對畜禽血液的利用率和加工程度普遍偏低，產品主要是以飼用血粉和食用血豆腐等為主的初加工產品（Wang等，2014；張玉斌等，2011）。已有研究表明，牛血相較于豬血等其他畜血營養豐富，其蛋白質含量較高，富含礦物質元素和氨基酸，且賴氨酸含量較高 （趙曉丹等，2016）。但同時也存在腥味較重、消化性和適口性差、色澤感官不佳且原料血液極難保存等缺陷。飼料加工領域中采用微生物發酵法處理畜血成本低，能提高營養成分的利用率，可以去除多種抗營養因子，而且能生成有益的代謝產物和益生菌 （杜昕等，2017；魯云風等，2010）。陳宇等（2003）采用復合菌株對豬血進行發酵，發酵產品香味濃郁 ，營養豐富，蛋白質含量高達 69% ，且富含游離氨基酸和無機元素。張濱等（2005）采用多菌種發酵而成的微生態多菌株發酵血液產品，含可溶性蛋白質達20%以上，且發酵血液具有特殊的芳香，無異味。方俊等（2006）研究發現，發酵溫度與時間及接種量對豬血小肽的生成有顯著影響。俞煒洋（2012）研究發現，豬血發酵后粗蛋白質降解劑量、氨基酸含量顯著提高，并有部分蛋白質降解成為小肽。程偉等（2014）研究表明，在生長豬飼糧中使用6%～7%微生物發酵復合蛋白質原料替代豆粕可顯著提高其平均日增重、營養物質表觀消化率和經濟效益。

我國是牦牛主產國，飼養量占世界牦牛總數的90%以上，具有明顯的數量優勢 （楊斌等，2010）。牦牛生存在基本無污染的特殊環境，牦牛產品及副產物被認為是真正的綠色產品（Wang等，2007）。目前采用微生物發酵法處理牦牛血的研究較少，特別是對于牦牛血的發酵菌種組合及發酵工藝鮮有報道，本研究旨在通過探究能優化牦牛血營養結構、增加適口性的牦牛血最佳發酵菌種組合及發酵條件，提高牦牛血的深度和綜合利用價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 新鮮牛血液采自四川省新都區牦牛屠宰場，添加0.3%檸檬酸鈉混合均勻；酵母菌（安琪高活性干酵母，購于安琪酵母股份有限公司）、黑曲霉菌（黑曲霉孢子粉，購于河南中廣農業信息開發有限公司）、米曲霉菌（米曲霉孢子粉，購于沂源康源生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 固態發酵 以麥麩為輔料，按照一定比例加入新鮮牛血，用電子天平精確稱取葡萄糖2%，尿素0.4%，相應添加量的磷酸二氫鉀混合均勻，裝入透氣的40目篩子中，蓋上紗布，加少量水保持濕潤，放置試驗設定溫度的培養箱中恒溫培養。

1.2.2 可溶性蛋白質含量測定 按照中華人民共和國輕工行業標準大豆肽粉標 （QB/T2653-2004）：稱取樣品 2.00 g，加入 15%三氯乙酸（TCA）溶液 10 mL，混合均勻，靜置 5 min。將溶液定量轉移，在4000 r/min下離心10 min后，取全部上清液，按照粗蛋白質的檢測方法測定其含氮量（張麗英，2007）。

1.2.3 菌種篩選試驗 參照李建鑫等（2000）的方法，采用正交試驗設計對牦牛血發酵的菌種組合進行篩選。采用L9（33）正交試驗設計，設置菌種組合、發酵溫度及磷酸二氫鉀添加量3個因素，每因素3水平（見表1）。

表 1 L9（33）正交試驗設計表

1.2.4 單因素試驗 選用磷酸二氫鉀添加量、麥麩添加量、菌種接種量、發酵溫度、發酵時間、菌種添加比例6個因素進行單因素試驗。

1.2.4.1 發酵時間 按照0.3%的菌種接種量，菌種比例為1∶1，麥麩添加量為50%，磷酸二氫鉀添加量為0.4%，混合均勻，在30℃恒溫，分別培養24、36、48、60、72 h，每個處理設置 2 個平行。

1.2.4.2 發酵溫度 按照0.3%的菌種接種量，菌種比例為1∶1，麥麩添加量為50%，磷酸二氫鉀添加量為0.4%，混合均勻，分別在24、26、28、30、32℃恒溫培養72 h，每個處理設置2個平行。

1.2.4.3 菌種接種量 按照磷酸二氫鉀添加量為0.4%，菌種比例為1∶1，麥麩添加量為50%，黑曲酶接種量分別為 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，混合均勻，每個處理設置2個平行，在30℃恒溫培養72 h。

1.2.4.4 磷酸二氫鉀添加量 按照0.3%的菌種接種量，菌種比例為1∶1，麥麩添加量為50%，分別添加磷酸二氫鉀為 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，混合均勻，每個處理設置2個平行，在30℃恒溫培養72 h。

1.2.4.5 麥麩添加量 按照0.3%的菌種接種量，磷酸二氫鉀添加量為0.4%，菌種比例為1∶1，麥麩含量分別為 30%、40%、50%、60%、70%，加入新鮮牛血混合均勻，每個處理設置2個平行，在30℃恒溫培養72 h。

1.2.4.6 菌種添加比例 按照0.3%的菌種接種量，尿素添加量為0.4%，麥麩添加量為50%，磷酸二氫鉀添加量為0.4%，菌種添加比例為0.2、0.6、1、1.4、1.8，加入新鮮牛血混合均勻，每個處理設置2個平行，在30℃恒溫培養72 h。

1.2.5 響應面法優化設計試驗 參照李明華等（2016）的方法，以單因素試驗為基礎，最終篩選出3個自變量：發酵時間、發酵溫度、輔料比例作為響應面分析的因素，采用響應面法依據Box-Behnken試驗原理設計3因素3水平試驗，進一步優化最佳工藝條件。檢測指標為可溶性蛋白質增加量，試驗編碼和水平如表2所示。

表2 試驗因素水平及編碼

1.3 統計分析 正交試驗及單因素試驗利用SPSS 18.0進行分析作圖，響應面試驗數據采用Design-Expert V8.0.6軟件處理分析。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選試驗 由表3可知，因素A及菌種組合對可溶性蛋白質的增加量有顯著影響 （P＜0.05）。發酵溫度、磷酸二氫鉀添加量對發酵牦牛血中可溶性蛋白質含量無顯著影響（P＞0.05）。其中酵母菌+黑曲霉的組合可溶性蛋白質增加量顯著高于酵母菌+米曲霉和黑曲霉菌+米曲霉的菌種組合，因此篩選出酵母+黑曲霉為最佳組合并用于后續試驗。

表 3 L9（33）正交試驗結果

2.2 單因素試驗 采用酵母菌加黑曲霉的組合發酵牦牛血，發酵時間、發酵溫度、菌種添加量、磷酸二氫鉀添加量、麥麩添加量、酵母菌與黑曲霉的菌種比例對可溶性蛋白質含量的影響，如圖1所示。由圖1-a和1-b可以看出，發酵時間和發酵溫度對可溶性蛋白增加量影響顯著，且隨發酵時間和發酵溫度增加呈現先增加后減小的趨勢。最適發酵時間為48 h左右，最適發酵溫度為28℃左右。由圖1-c和1-d可知，菌種添加量達到0.3%后對可溶性蛋白質含量影響不顯著；磷酸二氫鉀對可溶性蛋白質含量影響不顯著。由圖1-e可以看出，麥麩添加量對可溶性蛋白質的含量影響顯著，且隨著麥麩添加量的增加呈增加的趨勢；由圖1-f可知，酵母菌與黑曲霉的菌種比例對發酵牦牛血中可溶性蛋白質含量的影響顯著，在酵母菌和黑曲霉比值為0.6左右時可溶性蛋白質含量最高。

2.3 響應面試驗分析

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 如表4所示，按照Box-Benhnken設計進行試驗，所得數據由Design Expert 8.0.6軟件進行分析，建立R1（可溶性蛋白質增加量）關于編碼自變量A（菌種比例）、B（發酵溫度）、C（麥麩添加量）的二次多項回歸方程：

圖1 單因素對可溶性蛋白質含量的影響

表4 響應面試驗設計與結果

對二次多項回歸方程進行多因素方差分析可知（表5），本試驗構建的二次多項模型具有極高的顯著性（P ＜0.001），失擬項不顯著（P=0.554），表明該模型與試驗擬合良好，自變量與響應值之間存在顯著的線性關系，能夠描述和預測不同培養條件對小肽增加量的影響。

表5 回歸模型方差分析表

由表5可知，回歸方程一次項C的P值小于0.01，影響極顯著，而A的P值小于0.05，影響顯著，表明菌種比例和麥麩添加量因素均能顯著增加可溶性蛋白質的含量；二次項C2的P值小于0.05；交互項的P值均大于0.05，表明三個因素之間沒有互作效應。上述結果說明，小肽增加量會受到以上2個因素的影響，且影響程度依次為：輔料比例＞菌種比例。

2.3.2 二次項交互分析 菌種比例、發酵溫度和麥麩添加量兩兩交互作用對可溶性蛋白增加量的影響如圖2～4所示。

由圖2～4可以看出，菌種比例與發酵溫度、菌種比例與麥麩添加量、發酵溫度與麥麩添加量的交互作用均不顯著。一個因素不變，隨著其他因素的變化，可溶性蛋白質呈現先增大后減小的趨勢，可溶性蛋白增加量呈現極值。

2.3.3 回歸模型的驗證 應用Design-Expert 8.0.6軟件求得二次曲面方程的極值得到：當酵母菌和黑曲霉比例為0.4、發酵溫度為30℃、輔料比例為73.5%時，可溶性蛋白質增加量最高，為8.25%。為確保回歸模型推算的預測值相對準確，本試驗又對優化后的培養條件進行驗證，并對原始培養條件下和優化條件下的小肽含量進行對比，結果如表6所示，與原始培養條件相比，響應曲面優化的小肽含量提高了8.4%，表明實際值與預測值擬合程度高，在優化后的培養條件下能夠有效提高小肽的含量，且粗蛋白質含量增加，粗纖維含量減少。

圖2 菌種比例和發酵溫度對可溶性蛋白增加量的響應曲面

圖3 菌種比例和麥麩添加量對可溶性蛋白質增加量的響應曲面

圖4 發酵溫度和麥麩添加量對可溶性蛋白質增加量的響應曲面

表6 原始培養條件下與優化后營養成分的對比%

3 結論

本文采用不同菌種組合對牦牛血進行發酵，發現黑曲霉、米曲霉、酵母菌的不同組合對牦牛血發酵后可溶性蛋白質的含量有顯著影響，通過L9（33）正交試驗篩選出最佳組合為黑曲霉+酵母菌組合。在單因素條件試驗的基礎上進一步利用Box-Behnken試驗設計原理構建牦牛血發酵工藝的響應面模型，并通過回歸分析得到最佳的發酵工藝條件為：菌種添加量0.3%、菌種比例（酵母菌比黑曲霉）0.4、發酵溫度30℃、輔料比例73.5%、發酵時間48 h、磷酸二氫鉀添加量0.4%，并驗證在此條件下發酵牦牛血可溶性蛋白質含量增加8.4%，與預測值基本符合，并且發酵后改變了牛血的營養結構，增加了粗蛋白質含量，減少了粗纖維含量，顏色鮮亮，具有酵母發酵的香味。