豬CAⅢ基因CDS 區克隆、生物信息學及組織表達分析

樂寶玉，張寧芳，成志敏，秦本源，吳怡琦，王媛媛，王鶴潔，蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CAs）是1932 年從牛血中分離出來的，并確定與血紅蛋白不同，命名為碳酸酐酶[1]，是一種廣泛存在于不同細胞內含鋅的金屬蛋白酶家族[2]，該家族能夠催化CO2的可逆水合反應，以維持酸堿平衡[3]。CA 有α，β，γ，δ，ζ，η 和θ 等7 個家族[1]，所有哺乳動物來源的CA 均屬于α 家族，其他家族主要見于植物、藻類、真菌及古細菌等[4]。α，β，γ 這3 個家族成員的晶體結構在三級和四級結構上完全不同，其結構隨種屬的不同而異，但其活性中心具有高度相似性，在每個碳酸酐酶的活性中心都結合了一個Zn2+[4]。現已確定，人碳酸酐酶總共有15 種亞型，這些同工酶因細胞定位和催化效率而不同。CAⅠ，CAⅡ，CAⅢ，CAⅦ，CAⅧ，CAⅩ，CAXⅢ是胞漿內酶，CAⅣ，CAⅨ，CAXII 和CAXIV 為胞膜相關蛋白，CAVA 和CAVB 是存在于細胞線粒體中，CAⅥ是分泌蛋白[1]。碳酸酐酶在多種生理功能中起著重要的作用，如連接代謝組織和肺CO2/HCO3-的呼吸和轉運，維持胞內pH 穩定和CO2平衡，參與生物合成反應、骨吸收、鈣化和腫瘤形成[2]，也與青光眼、水腫、癲癇、肥胖和癌癥等疾病有關，因此，其被認為是藥物靶標[1]。

豬CAⅢ基因位于4 號染色體4q→q14，有7 個外顯子和6 個內含子[3]。CAI 和CAⅡ與CAⅢ在碳酸酐酶家族成員中的相似性最高，因為他們不僅相對分子質量最接近，而且氨基酸序列也有較高的同源性。CAⅢ和CAⅡ互為同工酶，分子結構上有很多的相似，但它催化CO2水合的活性僅為CAII 的0.3%[5]。CAⅢ是主要存在于細胞質中的蛋白，主要分布于骨骼肌（在慢縮骨骼肌纖維中分布非常豐富）、肝臟和脂肪細胞中，分別約占10%，8% 和24%[6]，此外，CAⅢ在輸尿管平滑肌細胞、紅細胞、唾液腺、前列腺、肺、腎、結腸和睪丸等組織和細胞中均有表達，但表達量非常低[5]。

CAⅢ在清除胞內CO2、調節胞內pH、維持組織酸堿平衡、抗氧化、能量代謝和信號轉導等方面均發揮重要的作用，CAⅢ表達異常，還可能與多種臨床疾病的發生和發展有關。在一些肝癌細胞（SK-Hep1）中，CAⅢ能促進腫瘤細胞的侵入能力，是因為CAⅢ改變胞內或胞外pH 值激活FAK 信號通路起作用[7]。CAⅢ是脂肪分化形成的調節因子，對PPARc2 基因的表達起調控作用[8]。MITTERBERGER 等[9]研究證實，在前體脂肪細胞中降低CAⅢ基因的表達能促進脂肪生成。R?IS?NEN 等[10]研究發現，哺乳動物CAⅢ基因可能起到清除氧自由基的作用，從而保護細胞免受氧化損傷，而SHI 等[11]研究證實，CAⅢ保護成熟的骨細胞免受缺氧和氧化應激。GAILLY 等[12]用1 mmol/L H2O2誘導HK-2 細胞，能顯著增加CAⅢmRNA 的表達。說明CAⅢ可能是一種多功能酶，存在不同的組織中可能是為了保護細胞免受氧化損傷。

碳酸酐酶主要通過2 步反應催化CO2：第1 步是親核攻擊；第2 步是活性中心Zn2+-OH-的再生水分子自發脫氫，在轉運載體下將氫離子從疏水中心運出[13]。雖然CAⅢ屬于碳酸酐酶家族，但是對CAⅢ的生理作用并不了解，CAⅢ與CAI 和CAⅡ同工酶相比，催化二氧化碳水合- 脫水反應的活性非常低，主要是因為空間限制和Lys64 的存在代替His64，這是質子快速轉運出CAII 活性位點的重要殘留物[14]，CAⅢ與其他CA 同工酶相比，無論在組織分布還是生理功能上都有其獨特之處[15]。而關于CAⅢ的研究主要在鼠和人上，對豬的研究較少。

本研究克隆豬CAⅢCDS 序列，運用生物信息學進行分析，預測CAⅢ蛋白相關理化性質以及功能，采用qRT-PCR 技術檢測CAⅢ基因mRNA 表達譜和時序表達規律，旨在為揭示CAⅢ基因的生物學功能以及研究其分子遺傳機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及樣品采集 試驗動物由大同種豬場提供。選擇0，1，2，3，4，5 月齡的大白豬和馬身豬共48 頭，每品種每階段各4 頭，公母各1/2，公豬在28 日齡斷奶時去勢。在達到日齡當天屠宰，屠宰后采集心臟、肝臟、胰臟、肺、胃、背最長肌、背部皮下脂肪、脾臟、盲腸等9 種組織，放入凍存管，立即投入液氮中貯存備用。

1.1.2 主要試劑 2×Es Taq MasterMix 購自北京康為世紀生物科技有限公司；pMD 18-T Vector，RNAisoTMPlus，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反 轉 錄 試 劑 盒，DL 1 000 DNA Marker，DH5α，SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；IPTG 及X-Gal 購自依托華茂生物科技有限公司；RNase-Free ddH2O、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；乙醇、異丙醇、氯仿等常規生化試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA 提取 按照RNAisoTMPlus 方法提取總RNA 后，用1% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用核酸蛋白測定儀（NanoDrop 1000）測定總RNA的純度和濃度，A260/A280值為1.9～2.0，質量濃度在1 000 ng/μL 左右，將其稀釋至500 ng/μL，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書進行反轉錄。

1.2.2 引物合成與設計 根據NCBI 中已報道豬CAⅢ（GenBank：AY789514）和18S rRNA（GenBank：NR_046261）序列，利用Premier 5.0 設計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。

表1 引物序列信息

1.2.3 CAⅢ基因CDS 區擴增和克隆 以1 月齡馬身豬肌肉組織cDNA為模板，擴增CAⅢCDS區。總反應體系20 μL：上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 6 μL，2×Es Taq Master Mix 10 μL，cDNA 模板2 μL。PCR 反應程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個循環；72 ℃5 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，將條帶進行切膠回收，根據瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明書步驟進行操作。回收產物用核酸蛋白測定儀（ND1000）檢測濃度。回收產物與pMD 18-T Vector 在16 ℃連接30 min，之后轉化DH5 α 感受態細胞中，涂于Amp+（含有IPTG 和xgal）平板中，37 ℃過夜培養后挑取白色菌落于Amp+液體培養基上，37 ℃培養12 ～16 h，之后進行菌液PCR，用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，合格的菌液選1 mL 送華大公司進行測序。

1.2.4 生物信息學分析 利用DNAMAN 軟件將測序結果進行拼接和翻譯；使用在線軟件ExPASy 中的ProtParam 分析蛋白質理化性質，使用ProtScale預測蛋白質疏水性和親水性，使用SignalP 4.1 預測蛋白質信號肽，使用NetPhos 3.1 Serve 預測磷酸化位點，使用Psort II 預測亞細胞定位，使用Phyre 2.0預測蛋白質三級結構。

1.2.5 CAⅢ基因表達特性分析 以1 月齡馬身豬的9 個組織以及不同月齡大白豬和馬身豬背最長肌cDNA 為模板，采用qRT-PCR 檢測CAⅢ基因在不同組織中的表達譜及在不同月齡的發育性表達規律。反應總體積10 μL，包括2×SYBR Premix Ex Taq II 5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.7 μL；反應程序為：95 ℃，3min；95 ℃5 s，60 ℃10 s，72 ℃30 s，45 個循環；95 ℃15 s，65 ℃5 s，95 ℃50 s。每個樣本進行3 次重復，用2-ΔΔCt法對定量結果進行分析。

1.3 數據處理與分析

使用GraphPad Prism 7 做圖，數據用“平均值±標準誤”表示，使用SPSS Statistics 24 軟件進行顯著性分析，采用Duncan's 法進行多重比較（P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著）。

2 結果與分析

2.1 CAⅢ基因CDS 擴增及克隆測序

采用RT-PCR 擴增CAⅢ基因CDS 區，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產物與預期目的條帶大小一致（圖1）。經克隆測序獲得馬身豬CAⅢ基因的CDS 序列，該序列長783 bp，編碼260 個氨基酸（圖2）。經比對，本研究獲得的CAⅢ基因編碼序列與NCBI 收 錄 豬CA Ⅲ基 因（GenBank：AY789514.1）CDS 之間的相似度為100%。

2.2 生物信息學分析

根據獲得的馬身豬CAⅢ基因CDS 序列，利用DNAMAN 軟件翻譯成蛋白質序列（圖2），對CAⅢ蛋白的理化性質及特點進行預測，結果表明，該蛋白質包含260 個氨基酸，分子式為C1332H2022N362O378S8，分子量為29 ku，負電荷氨基酸殘基（Asp＋Glu）總數30，帶正電荷氨基酸殘基（Arg＋Lys）總數31，等電點為7.72，CAⅢ蛋白為堿性蛋白。在哺乳動物網狀紅細胞體外表達的半衰期為30 h，不穩定系數（II）為33.92，脂肪系數為73.54，總平均親水性為-0.521。綜上所述，該蛋白為堿性親水性蛋白。

疏水性預測分析結果如圖3 所示，CAⅢ蛋白在143 位點有最大值2.744，疏水性最強；在13 和14 位點有最小值2.556，親水性最強，且親水性蛋白多于疏水性蛋白，推測CAⅢ基因編碼的蛋白質多肽鏈是親水性蛋白，與蛋白質理化性質預測的結果一致。對CAⅢ蛋白的序列進行信號肽預測（圖4），得到C 值（剪切位點值）為0.108，Y 值（Y-max是綜合考慮S 值和C 值的一個參數）為0.102，S 值為0.121，D 值（S-mean 和Y-max 的平均值）為0.107，CAⅢ蛋白在Y 值曲線沒有出現峰值，S 值＜0.5，說明CAⅢ蛋白很可能不存在信號肽。蛋白修飾磷酸化位點預測，當潛在磷酸化位點的閾值為0.5 時，該位點存在磷酸化位點，則CAⅢ蛋白潛在的磷酸化位點有絲氨酸19 個位點，蘇氨酸3 個位點，酪氨酸12 個位點（圖5）。亞細胞定位預測結果顯示，CAⅢ蛋白主要分布在細胞質，其次是細胞核，在過氧化物酶體和線粒體中也有分布（表2），由此推斷，CAⅢ蛋白主要在細胞質中發揮生物學作用。對CAⅢ蛋白的二級結構預測結果表明，該蛋白α- 螺旋區域有39 個氨基酸，占15%；參與形成延伸鏈的氨基酸有68 個，占26.15%；β- 轉角區域有13 個氨基酸，占5%；參與形成無規則卷曲的有140 個氨基酸，占53.85%（圖6）。三級結構預測結果顯示，CAⅢ蛋白由α- 螺旋、β- 轉角以及無規則卷曲等一系列復雜的過程形成了一個穩定的結構（圖7）。

表2 CAⅢ蛋白質的亞細胞定位預測

2.3 豬CAⅢ基因時空表達特性分析

2.3.1 CA Ⅲ基因mRNA 表達譜分析 采用qRT-PCR 技術對1 月齡馬身豬心臟、肝臟、胰臟、肺、胃、背最長肌、皮下脂肪、脾、盲腸等9 個組織中CAⅢ基因的表達規律進行檢測，結果表明，CAⅢ基因mRNA 在不同組織中均有表達，其中，在背最長肌中的表達量最高；其次為胰臟；在肝臟、皮下脂肪、脾臟、肺、盲腸、胃中低表達（圖8）。

2.3.2 大白豬和馬身豬背最長肌CAⅢ基因mRNA時序表達 對從初生到5 月齡大白豬和馬身豬背最長肌中CAⅢ基因mRNA 的時序表達規律進行研究，結果發現，在大白豬中，CAⅢ基因mRNA 表達量呈上升—下降—上升—下降的趨勢，初生時最低，1 月齡時表達量升高，2 月齡時下降，此后表達量再次上升，到3 月齡時達到峰值，之后開始下降。在馬身豬中的表達規律和大白豬中基本相似，但在5 月齡時表達量最高，極顯著地高于其他各個階段（P＜0.01）（圖9）。

由圖9 還可知，同一月齡大白豬和馬身豬之間比較，在0，1，2 月齡中大白豬和馬身豬CAⅢmRNA表達量差異不顯著，而在3 月齡以后2 個品種CAⅢmRNA 表達量差異顯著，3 月齡和4 月齡時，大白豬CAⅢmRNA 表達量顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）地高于馬身豬，而在5 月齡時，馬身豬CAⅢmRNA 表達量極顯著地高于大白豬（P＜0.01）。

3 結論與討論

本研究成功獲得豬CAⅢ基因CDS 序列，并通過生物信息學方法對豬CAⅢ基因編碼的蛋白質組成結構及生物學特性進行預測和分析，結果表明，該基因CDS 區783 bp，編碼260 個氨基酸，是一個堿性親水蛋白，有34 個磷酸化位點，其中，酪氨酸磷酸化位點有12 個。酪氨酸磷酸化在生長因子信號傳導和增殖中發揮重要的作用[16]，推測CAⅢ蛋白與細胞增殖有關。本試驗預測，CAⅢ蛋白亞細胞定位主要在細胞質中，而α-CA 家族中CAI，CAII，CAⅢ，CAVII 和CAXⅢ均屬于細胞質酶，預測結果與他人研究結果一致[17]，由此推斷，豬CAⅢ基因編碼的蛋白主要在細胞質中發揮作用。

有研究表明，CAⅢ基因在不同組織中均有表達，但主要在骨骼肌中表達，它可以代表8%的慢肌纖維骨骼肌的可溶性蛋白質[18]。本研究中，CAⅢ基因在背最長肌中表達量最高，其次是胰臟，研究結果與前人研究結果一致。就時序發育規律而言，CAⅢ具有獨特而復雜的發育模式，在發育的特定階段和整個成年期的3 種不同的中胚層組織中表達。骨骼肌中CAⅢ水平并不隨動物的性別或胖瘦程度而改變，但會隨動物的發育而發生明顯變化[19]。CAⅢ基因表達的第1 個位點是發育中的脊索[20]，胚胎的主要軸向結構[21]，當脊索不再是連續結構時，CAⅢmRNA 存在于脊椎殘余物中，即每個椎間盤中心的髓核。CAⅢ表達的第2 階段是在發育中的肌肉中，一旦肌肉分化并隨著發育的進行而延伸到所有骨骼肌[20]，就會通過CAⅢ轉錄物限制成熟的I 型慢纖維來細化差異肌肉塊內的表達[22]，出生后，CAⅢ蛋白在慢肌纖維中高表達[23]。CARTER 等[24]測定了人胚胎和嬰兒時期骨骼肌中CAⅢ的表達量，結果表明，CAⅢ在11 周的胚胎中低表達，15 周時開始升高，相當于成人表達量的10%，20 周為成人表達量的20%，新生兒的表達量為成人的1/2。本研究中，在生長前期，隨著年齡的增加，在大白豬和馬身豬中，CAⅢ基因mRNA 的表達基本呈上升趨勢；在大白豬中，在3 月齡時CAⅢmRNA 表達量達到峰值，而在馬身豬中，在5 月齡達到峰值，這與CARTER[24]的研究結果基本一致，也與CAⅢ促進細胞增殖的功能相一致。DAI 等[7]研究發現，在SK-Hep1 肝癌細胞中過表達CAⅢ可導致細胞的過度增殖和侵襲力增加，CAⅢ增加可促進細胞的增殖，這有可能是造成大白豬比馬身豬發育快的原因之一。

就品種間比較而言，在3 月齡之前，背最長肌中CAⅢmRNA 的表達在大白豬和馬身豬中無顯著差異；在3 月齡以后，2 個品種的CAⅢmRNA 表達量差異顯著，3 月齡和4 月齡時，大白豬CAⅢmRNA 表達量顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）地高于馬身豬，而在5 月齡時，馬身豬CAⅢmRNA表達量極顯著地高于大白豬（P＜0.01），這可能與CAⅢ基因的表達特性及大白豬和馬身豬骨骼肌肌纖維類型的組成不同有關。馬身豬為我國地方豬種，大白豬為引入豬種，二者肌肉組織在肌纖維類型上存在顯著差異，在生長發育后期，馬身豬骨骼肌中慢肌纖維的比例顯著高于大白豬，而CAⅢ基因主要在慢肌纖維中表達，這就導致5 月齡時，馬身豬骨骼肌中CAⅢ基因mRNA 的表達量顯著高于大白豬，具體的作用機制仍需進一步研究。