甘蔗酒釀造酵母的篩選

應(yīng) 靜 游 玲 馮學愚 - 王 濤 邱樹毅 -

(1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2. 宜賓學院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644000；3. 成都師范學院化學與生命科學學院，四川 成都 611130)

酵母作為果酒發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生不同代謝物質(zhì)，直接決定酒體香氣和口感，影響果酒品質(zhì)[1-2]。目前常用于果酒發(fā)酵的商業(yè)酵母包括EC1118、FX10、DV10、EC1110、RC212、Q23等菌株，研究發(fā)現(xiàn)這些菌株對果酒品質(zhì)的影響各異，Q23酵母發(fā)酵的菠蘿酒風味最佳[3]，EC1118菌株具有較低的高級醇生成量，廣泛用于葡萄酒[4]、蘋果酒[5]、獼猴桃酒[6]等果酒生產(chǎn)，所釀葡萄酒花香濃郁，刺激性較小[7]，其發(fā)酵后的紅棗酒酒精度高且發(fā)酵液易過濾，成品酒中甲醇含量與安琪、FX10、DV10、EC1110、RC212菌株發(fā)酵后的紅棗酒相當[8]。上述常用果酒釀造酵母中，僅安琪酵母廣泛用于甘蔗酒釀造，在最佳發(fā)酵工藝條件下乙醇濃度為7.6%[9]。部分研究人員[10-11]也從自然環(huán)境中分離、篩選甘蔗酒釀造酵母用于甘蔗酒生產(chǎn)，使釀造的甘蔗酒保留了特有的甘蔗香，但由于這些原料來源酵母在發(fā)酵過程中存在成熟繆殘?zhí)呛扛摺⑷菀装l(fā)生酸敗現(xiàn)象、發(fā)酵水平不高等問題[12-13]，相關(guān)菌株尚未進行商業(yè)化推廣應(yīng)用。

甘蔗酒是以新鮮甘蔗汁、甘蔗渣或甘蔗糖蜜為原料，經(jīng)酵母發(fā)酵后蒸餾或直接過濾得到的帶有甘蔗香味的酒[14]，其營養(yǎng)豐富[15]，口感香甜[16]。甘蔗酒的釀造關(guān)鍵在于酵母菌株的篩選，所選用的酵母發(fā)酵性能直接影響甘蔗酒風味和品質(zhì)[17-18]。目前，甘蔗酒釀造普遍采用安琪酵母，或原料來源的野生型酵母，存在風味較為單一，香氣不足，耐酒精能力低，發(fā)酵水平不高等問題，因此，亟待篩選出甘蔗酒釀造的專用酵母，以改善甘蔗酒風味，提高甘蔗酒質(zhì)量。

本研究擬以新鮮甘蔗為原料，選用5種常用于果酒釀造的商業(yè)酵母菌株及1株分離自濃香型白酒糟醅的產(chǎn)香酵母菌株釀造甘蔗酒，通過比較不同酵母甘蔗發(fā)酵液的理化指標，分析成品甘蔗酒中甲醇含量及主要揮發(fā)性風味物質(zhì)，對甘蔗酒進行感官評價，旨在為優(yōu)質(zhì)甘蔗酒釀造篩選合適的酵母，為甘蔗酒的研發(fā)和甘蔗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甘蔗：川蔗17，購自宜賓當?shù)剞r(nóng)戶所栽種甘蔗；

酵母菌株：KD、DV10、EC1118、Q23，法國萊蒙特葡萄酒酵母公司；

安琪活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；

H7Y7產(chǎn)香酵母菌株：分離自白酒糟醅，現(xiàn)保存于宜賓學院生命科學與食品工程學院四川省固態(tài)發(fā)酵資源利用省重點實驗室；

叔戊醇：色譜純，成都市科隆化學品有限公司；

正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乙醛、乙縮醛12組分混合標樣：色譜純，鄭州譜析科技有限公司；

YPD固體培養(yǎng)基：1% 酵母膏，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，2% 瓊脂粉，pH自然， 121 ℃滅菌30 min。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜儀：Agilent 7890A型，安捷倫科技有限公司；

榨汁機：WJ-80A型，廣州萬將家電有限公司；

紫外可見分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限責任公司；

數(shù)顯糖度計：PAL-1型，維欣儀奧科技公司；

恒溫水浴鍋：HH.WH.600S型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 菌種活化及擴大培養(yǎng) 直接挑取平板培養(yǎng)24 h的H7Y7菌株單菌落，并稱取EC1118、DV10、Q23、KD、安琪酵母干粉各1 g分別加入到200 mL 4%葡萄糖及甘蔗汁的等體積混合溶液中，25 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，加入無菌水調(diào)整酵母數(shù)為108CFU/mL，備用。

1.2.3 發(fā)酵 選取新鮮、無病蟲霉爛的成熟甘蔗，洗凈、榨汁，在甘蔗汁中加入適量亞硫酸(最終濃度為80 mg/L)[19]以抑制雜菌生長，將處理好的甘蔗汁裝入2 000 mL 廣口瓶，裝液量90%[8]，分別接入20 mL菌液，瓶口用4層無菌紗布封口，于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵，當發(fā)酵液開始出現(xiàn)大量氣泡時，補加120 g蔗糖繼續(xù)發(fā)酵[20]，直至發(fā)酵液不再有大量氣泡冒出，糖度不再減少，瓶底有沉淀時結(jié)束發(fā)酵。

1.2.4 蒸餾 將發(fā)酵結(jié)束的2 000 mL發(fā)酵液在80 ℃，-65 kPa條件下進行減壓蒸餾，蒸餾瓶上端設(shè)置10 cm冷卻回流裝置，并去掉首段10 mL餾出液，收集中間段得到甘蔗酒。

1.2.5 糖度測定 根據(jù)文獻[3]。

1.2.6 酒精含量測定 按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的酒精計法執(zhí)行。

1.2.7 透光率測定 根據(jù)文獻[21]。

1.2.8 甲醇含量測定 按GB 5009.266—2016《食品安全國家標準 食品中甲醇的測定》的氣相色譜毛細管柱內(nèi)標法執(zhí)行。

1.2.9 香氣成分測定 根據(jù)文獻[22]修改如下：采用Lzp930毛細管柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣體積1 μL；載氣流速氮氣(N2)1.5 mL/min；分流比40∶1；進樣口溫度220 ℃；氫火焰離子化檢測器 220 ℃；柱溫升溫程序：柱溫55 ℃，保持3 min，以3.5 ℃/min升溫至150 ℃，保持1 min；最后以10 ℃/min升溫至200 ℃，保持30 min。相同條件下測定3個平行樣，數(shù)據(jù)取平均值。

1.2.10 感官評價 參照 Q/GYY0001S—2016、DBS45 004—2013及GB/T 15038—2006，制定了適合于甘蔗酒的感官評分標準。選取20位(10男10女)經(jīng)過感官評定訓練的食品專業(yè)學生組成評價小組，嚴格按照品評相關(guān)要求，對不同酵母發(fā)酵的甘蔗酒從色澤、香氣、口感和風格4個方面進行感官評定，并填寫感官評定表，取平均值作為產(chǎn)品的綜合評分。評分標準如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進行處理,Origin 8.0軟件進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌株對甘蔗發(fā)酵液理化性質(zhì)的影響

2.1.1 對耗糖情況的影響 由圖1可知，6種酵母在甘蔗酒發(fā)酵過程中總耗糖量逐漸增加，最終耗糖量依次為菌株EC1118>KD>DV10>Q23>安琪酵母>H7Y7，其中，KD、DV10、Q23和EC1118菌株在發(fā)酵1 d左右起酵，開始大量耗糖。安琪酵母在發(fā)酵2 d左右起酵，且可觀察到發(fā)酵液中有大量氣泡冒出，說明發(fā)酵旺盛。發(fā)酵6 d后，Q23和安琪酵母菌株的耗糖量不再明顯增加，KD、DV10 2種酵母在發(fā)酵的1～7 d耗糖速率和耗糖量基本一致，H7Y7起酵較晚，到3 d左右才開始大量耗糖，且耗糖速度慢，最終耗糖量低于其他供試酵母，僅142 g/L，比耗糖量最高的EC1118少47 g/L，說明其發(fā)酵能力相對較差。

表1 甘蔗酒感官評分

2.1.2 對澄清度的影響 發(fā)酵液透光率直接反映澄清度，不同酵母菌株發(fā)酵的甘蔗汁透光率都呈先減少再增加的趨勢，與王洋等[23]研究結(jié)果一致。不同酵母菌株因自身絮凝沉降能力差異而對發(fā)酵液澄清度產(chǎn)生不同程度的影響(圖2)。由圖2可知，EC1118、H7Y7、KD、DV10菌株在發(fā)酵第4天透光率達最低，Q23和安琪酵母菌株在發(fā)酵第5天達最低，最終發(fā)酵液透光率安琪酵母最大為85%，其次是EC1118(80%)和Q23(73%)，透光率最低為DV10(54%)。由上可知，安琪酵母的絮凝能力最強，其發(fā)酵后的甘蔗汁澄清度最好，其次是EC1118菌株，DV10菌株最差。因此，若生產(chǎn)甘蔗釀造酒，可選擇絮凝能力較好的酵母菌株，如EC1118菌株發(fā)酵甘蔗汁，若生產(chǎn)甘蔗白蘭地或朗姆酒等，則可不考慮酵母對發(fā)酵液澄清度的影響。

圖1 不同酵母菌株對甘蔗發(fā)酵液中耗糖的影響

圖2 不同酵母菌株對甘蔗發(fā)酵液澄清度的影響

2.1.3 對乙醇生成量的影響 由圖3可知，菌株EC1118發(fā)酵甘蔗酒乙醇含量最大為10.8%，與安琪酵母(9.3%)、DV10 (9.2%)、H7Y7(8.9%)差異顯著，Q23與KD菌株在產(chǎn)乙醇方面無明顯差異，KD菌株發(fā)酵甘蔗酒產(chǎn)乙醇量最低，為7.8%。結(jié)合耗糖情況，EC1118菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇含量最高，發(fā)酵性能最好。

2.2 不同酵母菌株對甘蔗酒中甲醇含量的影響

甲醇是一種神經(jīng)毒物，含量過高，會對飲酒者健康帶來不利影響[24]。甘蔗酒中甲醇主要來源于果膠、纖維素降解等，這些都與發(fā)酵菌種本身代謝和發(fā)酵有關(guān)[25]。由圖4可知，安琪酵母發(fā)酵的甘蔗酒中甲醇含量最高，達到了588.901 mg/L，其次是KD菌株(130.911 mg/L)，其他4種酵母甲醇含量差別不大且偏低，均在GB 2757—2012規(guī)定的≤2.0 g/L(以100%酒精度計)內(nèi)。由此，使用EC1118、H7Y7、Q23和DV10菌株發(fā)酵生產(chǎn)甘蔗酒可更加有效減少酒中甲醇含量。

字母不同代表有顯著性差異(P<0.05)

2.3 不同酵母菌株對甘蔗酒中風味物質(zhì)的影響

使用氣相色譜結(jié)合外標法對不同酵母發(fā)酵甘蔗酒中12種主要揮發(fā)性物質(zhì)的檢測，結(jié)果見表2。

高級醇是構(gòu)成甘蔗酒香味的重要成分，也是多種酸、酯的前體物質(zhì),適量高級醇可使甘蔗酒口感豐滿醇厚，反之，則導致酒苦、辣、糙、澀，同時引起頭昏頭痛，對身體造成傷害[26]。由圖5可知，甘蔗酒中高級醇較多為異戊醇、正丙醇和異丁醇等。異戊醇具有濃郁的蘋果白蘭地香[27]，含量過多會影響酒的品質(zhì)，EC1118菌株發(fā)酵甘蔗酒中異戊醇為61.457 mg/L，明顯低于KD(114.818 mg/L)、DV10(73.659 mg/L)、Q23(100.054 mg/L)、H7Y7 (10 9.317 mg/L)和安琪 (146.532 mg/L)5種酵母；從高級醇總量來看，EC1118菌株發(fā)酵甘蔗酒高級醇總量最低為108.413 mg/L，說明EC1118菌株能有效降低甘蔗酒中高級醇含量，使酒液更純凈透明，香味豐富，口感柔和。此外，在甘蔗酒中還檢測了具有玫瑰香的β-苯乙醇和具有水果香[28]的正丁醇等，這些物質(zhì)是賦予甘蔗酒豐富香味不可忽視的揮發(fā)性成分。

圖4 不同酵母菌株對甘蔗酒甲醇含量的影響

表2 甘蔗酒主要揮發(fā)性風味物質(zhì)及含量?

? “ND”表示未檢測到該物質(zhì)。

酯類物質(zhì)具有令人愉悅的酯香和水果香氣，對甘蔗酒的芳香呈現(xiàn)重要作用[29]。由圖6可知，甘蔗酒中酯類較多為乙酸乙酯，乙酸乙酯賦予甘蔗酒濃郁的水果香，對其風味具有不可替代的作用。此外，檢測到具有蘋果香的己酸乙酯、酒香的乳酸乙酯、菠蘿香的丁酸乙酯及具有香蕉香的乙酸異戊酯等[30]。從產(chǎn)酯總量來看，H7Y7菌株發(fā)酵甘蔗酒中酯類物質(zhì)含量為29.258 mg/L，明顯高于KD(4.676 mg/L)、DV10(8.712 mg/L)、Q23(8.381 mg/L)、另外，甘蔗酒中還檢測了具有果香味的乙醛和具有花香味的乙縮醛，這2種醛類物質(zhì)在薛家?guī)X等[31]分析的以糖漿、廢糖蜜為原料生產(chǎn)的甘蔗酒中均未檢測出，可能是發(fā)酵原料和酵母種類差異所致，其中，KD和安琪酵母菌株發(fā)酵的甘蔗酒中乙醛和乙縮醛含量明顯低于其他4種酵母，醛類物質(zhì)在酒中含量雖少，卻是酒體風味形成必不可少的。甘蔗酒的風味不是由單一香味物質(zhì)組成，而是源于構(gòu)成香氣的酯類、酸類、醇類、醛酮類等物質(zhì)相互協(xié)調(diào)作用而形成，正是這些物質(zhì)，構(gòu)成了甘蔗酒特有的風味。

圖5 不同酵母對甘蔗酒高級醇含量的影響

圖6 不同酵母菌株對甘蔗酒酯類物質(zhì)含量的影響

EC1118(6.542 mg/L)和安琪(9.793 mg/L)5種酵母，以上結(jié)果說明，酵母H7Y7發(fā)酵生產(chǎn)的甘蔗酒酯香更為濃郁。

2.4 不同酵母菌株對甘蔗酒風味的影響

由表3可知，H7Y7菌株發(fā)酵的甘蔗酒評分最高為86分，澄清透亮，具有協(xié)調(diào)的甜香和酒香，酯香突出，風格獨特。EC1118菌株的次之，酒液無色透明，酒香明顯，風格典型。DV10菌株的具有正常的果香和酒香，香較協(xié)調(diào)，味較淡。安琪酵母和Q23菌株的感官評分結(jié)果較為接近，分別為70分和68分，酒香較好，果香不突出，口感一般，稍有酸味。KD菌株發(fā)酵的甘蔗酒評分最低為61分，味較雜，口感較差。H7Y7菌株發(fā)酵的甘蔗酒酯香突出，與其氣相檢測結(jié)果中酯類物質(zhì)含量最高相符，KD菌株發(fā)酵的甘蔗酒評分最低與高級醇含量高而酯類物質(zhì)含量低有關(guān)。由上表明，不同酵母菌株對甘蔗酒的感官品質(zhì)有明顯影響，H7Y7和EC1118菌株發(fā)酵的甘蔗酒風味優(yōu)于其他4株供試酵母菌株。

表3 不同酵母菌株對甘蔗酒感官風味的影響

3 結(jié)論

選用5種常用果酒酵母菌株KD、DV10、Q23、EC1118、安琪及1株分離自白酒糟醅的產(chǎn)香酵母H7Y7發(fā)酵甘蔗酒，篩選出了適合甘蔗酒釀造的酵母菌種EC1118和H7Y7。EC1118菌株產(chǎn)酒能力最大，甘蔗甜香、酒香明顯，H7Y7菌株發(fā)酵的甘蔗酒感官評分最高，酯香明顯，產(chǎn)酯能力強。EC1118菌株因其發(fā)酵性能好，用于多種果酒生產(chǎn)，本研究證實該酵母也適用于甘蔗酒發(fā)酵；H7Y7菌株作為分離自白酒糟醅的產(chǎn)香酵母，用于甘蔗酒發(fā)酵時也體現(xiàn)了很強的產(chǎn)酯生香能力，且目前該酵母菌株正在商業(yè)化過程中，也可作為甘蔗酒生產(chǎn)的備選酵母。后續(xù)將針對這2株酵母在甘蔗酒發(fā)酵中的應(yīng)用，優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并進一步探討雙菌混合發(fā)酵等工藝，為優(yōu)質(zhì)甘蔗酒的生產(chǎn)提供更多備選方案。