常壓室溫等離子體選育高產酒精及酸的釀酒酵母

王犁燁 - 王浩臣 - 馬 珊 劉維兵 - 李澤涵 -宋晶晶 - 楊華峰 - 張 穎 武 運

(1. 新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆維吾爾自治區科技項目服務中心，新疆 烏魯木齊 830011；3. 新疆儀爾高新農業開發有限公司，新疆 焉耆 841000；4. 吐魯番市質量與計量檢測所，新疆 吐魯番 838000)

隨著消費者對飲食健康及養生關注度的不斷加深，中國葡萄酒的需求量逐年增長，釀酒工業呈現快速發展態勢[1]。新疆作為中國最古老的葡萄種植產區，地區生態環境獨特，區位優勢明顯，是發展釀酒葡萄的理想產區[2]。但該地日溫差大、降雨量少，使得釀酒葡萄原料具有糖高酸低的特點，酸度過低會使葡萄酒顏色黯淡無光，口感單調、不清新，直接影響到新疆地區葡萄酒的品質[3-5]，因此需要選育高產酸的酵母菌株進行發酵，改善葡萄酒酸度低的現狀。

目前，通常采用傳統分離篩選的方法從自然界中篩選釀酒酵母菌株，但分離得到的野生菌株在發酵性能和功能上都具有一定的局限性。因此需要對已知菌株進行誘變，從基因層面上改變酵母菌的性質及功能，從而達到生產需要[6-8]。傳統的誘變方法操作復雜，對人體和環境存在一定的危害，新型常壓室溫等離子體(ARTP)生物誘變育種技術，因其操作簡單，對人體環境無毒無害，已成為生物誘變育種領域的一個研究熱點[9-11]。趙宇等[12]、曲文娟等[13]、秦艷飛等[14]采用ARTP對高核酸釀酒酵母、產蛋白酶菌株以及產恩拉霉素菌株進行處理，獲得生產所需的誘變菌株，但目前還沒有學者通過ARTP篩選高產酒精和酸的釀酒酵母。

本試驗擬以從葡萄表面篩選的Y6菌株為出發菌，通過ARTP誘變對其功能進行改造，以期獲得高產酒精及酸且發酵性能穩定的目標釀酒酵母菌株，通過微生物代謝來增加葡萄酒的酒精度和酸度，以提高新疆葡萄酒品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酵母菌株Y6：新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室提供；

酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；

葡萄糖、無水乙醇、：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetra-zolium chloride，TTC)：分析純，上海藍季生物科技發展有限公司；

溴甲酚綠：分析純，天津市北聯精細化學品開發有限公司；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂：青島高科園海博生物技術有限公司；

磷酸二氫鉀、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)：分析純，天津市光復科技發展有限公司。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)：20 g葡萄糖+20 g蛋白胨+10 g酵母浸粉+20 g瓊脂+1 000 mL 蒸餾水；

TTC上層培養基：0.05 g TTC+0.5 g 葡萄糖+2 g 瓊脂+100 mL 蒸餾水；

TTC下層培養基：10 g 葡萄糖+2 g 蛋白胨+ 5 g 酵母浸粉+1 g KH2PO4+0.4 g MgSO4·7H2O+20 g 瓊脂+1 000 mL 蒸餾水，調pH為5.5～5.7；

溴甲酚綠培養基：PDA基礎培養基+0.01%溴甲酚綠，調pH為 6.0。

1.1.3 儀器與設備

常壓室溫等離子誘變儀：ⅡS型，無錫源清天木生物科技有限公司；

分析天平：FA2014N型，北京東南儀誠實驗室設備有限公司；

立式高壓滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫療器械廠；

生物安全柜：HR40-A2型，青島海爾特種電器有限公司；

霉菌培養箱：MJX-160-Z型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

紫外可見光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

PH計：FE20 PLUS型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

手持糖度計：PAL-1型，北京陽光億事達科技有限公司；

漩渦混合器：VORTEX-5型，華利達實驗設備有限公司；

離心機：SF-TDL-6A型，上海菲恰爾分析儀器有限公司；

葡萄酒全自動檢測儀：Y15型，西班牙Biosystem公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 首先挑取一環存放于冰箱的Y6酵母菌接種于YPD液體培養基中，在28 ℃下培養24 h；然后將菌液以2%的接種量接入新配的YPD液體培養基中，在28 ℃下培養24 h后，制得菌懸液。

1.2.2 Y6酵母生長曲線的測定 將活化好的Y6菌液以5%的接種量接種到YPD液體培養基中，在28 ℃下培養，每間隔2 h取1次樣，在波長600 nm測吸光值，以空白培養基為對照，根據測得的吸光值繪制Y6酵母的生長曲線，確定Y6酵母的生長對數期。

1.2.3 ARTP誘變試驗 試驗參數：選擇純度為99.999% 的氦氣作為工作氣體，流量為10 SLM，電源功率設定為120 W，操作溫度20 ℃，處理時間分別為0，20，40，60，80，100，120，140 s。誘變試驗：在超凈工作臺中吸取1 mL 在液體培養基中培養至對數期的出發菌株Y6的菌液，在3 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌3次后吸取10 μL放在載片上，用無菌鑷子將載片依次放在對應的凹槽中，并將裝有1 mL YPD液體培養基的EP管固定在下方，即可進行誘變試驗，誘變后將裝有載片的EP管放在漩渦器上劇烈震蕩1 min，將誘變菌洗脫下來，梯度稀釋10-6～10-7后，吸取100 μL涂布在平板上，在28 ℃培養箱中避光培養48 h，計算致死率，選擇最佳誘變時間。

1.2.4 致死率計算

(1)

式中：

Z——菌株的致死率，%；

X1——ARTP誘變后的菌落數；

X——對照組的菌落數。

1.2.5 高產酒精及酸釀酒酵母初篩

(1) TTC培養基篩選：采用劃線法將挑選出的突變菌株接種于TTC下層培養基中，在28 ℃條件下培養48 h 后，在TTC下層培養基上覆蓋一層TTC上層培養基，并于28 ℃的條件下培養3 h，觀察培養皿中的顯色情況，從中篩選出產酒精能力強的突變菌株。

(2) 溴甲酚綠培養基篩選：先在培養皿中倒入一層剛好可以覆蓋培養皿底部的溴甲酚綠培養基，待其凝固后放入牛津杯，再在牛津杯外圍倒入一層溴甲酚綠培養基，培養基凝固后取出牛津杯，將TTC培養基篩選出的顏色較深的酵母菌株進行活化，將吸取100 μL 菌液環接種于牛津杯空洞內，在28 ℃條件下培養24 h，觀察黃色圈，選擇菌落周圍出現較大黃色圈的菌株進行發酵能力試驗。

(3) 菌株發酵能力測試：兩步篩選出的突變酵母菌株，以5%的接種量分別接種于裝有10 mL YPD液體培養基的試管中后，放入杜氏小管，并確保杜氏小管內無氣泡，在28 ℃的條件下培養，每12 h觀察一次突變菌株產氣情況，記錄杜氏小管內的填充度。根據試驗結果，篩選出發酵性能好，起酵快、生長旺盛的菌株。

1.2.6 高產酒精及釀酒酵母的復篩 將葡萄汁115 ℃，滅菌20 min，分裝在5個三角瓶中，每瓶150 mL，測定葡萄汁的糖度為23.6 Brix，總酸為4.94 g/L。將上幾步篩選的誘變菌株和出發菌株同時以5% 的接種量接種于葡萄汁中，在25 ℃條件下培養10 d，測定菌株產酒精和產酸能力，確定目標菌株。

1.2.7 遺傳穩定性試驗 將突變酵母菌株連續傳代培養5次，將每一代菌株以5%的接種量接種于糖度為22.8 Brix，總酸為5.32 g/L的葡萄汁中，在28 ℃條件下培養10 d，測定突變菌株的產酒精和產酸能力，從而驗證菌株的突變性能是否能夠穩定遺傳。

1.3 數據處理

試驗數據通過 Excel 2018 軟件及 Origin 8.5 軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 Y6酵母菌生長曲線

酵母菌株所處的生理狀態在一定程度上影響了菌株誘變的效果，酵母菌處于對數生長期時，其個體之間的形態、化學組成和生理特性等基本一致，數目以穩定的幾何指數增長且對環境因素的作用十分敏感[15-16]。因此，在此階段進行誘變，可以增加基因突變、穩定遺傳的幾率[17]。如圖1所示，將Y6酵母菌接入液體培養基中，前4 h 酵母菌處于遲緩期，微生物的代謝系統需要適應新環境，因此數目增長緩慢。在4～16 h酵母菌數量增長迅速處于對數生長期，在16 h后酵母菌進入穩定期，因此本試

圖1 Y6酵母菌生長曲線

驗選擇在10 h時對酵母菌進行誘變試驗。

2.2 最佳誘變時間的確定

誘變處理劑量或時間不僅影響致死率，同時影響突變效率，在一個合適的突變效率區間進行有效的篩選是菌種選育的關鍵之處[18]。如圖2所示，隨著常壓室溫等離子體處理時間的延長，Y6酵母的致死率急劇升高，當處理時間為100 s時，致死率達到98.7%，當處理時間為120 s 時，酵母菌無一存活，說明常壓室溫等離子體產生的活性粒子能夠破壞細胞結構，也能夠穿過細胞壁到達細胞內打斷基因、蛋白質分子等，從而導致大部分微生物死亡[19]，但當能量適中時，少數經過ARTP照射的酵母菌會通過本身的自動修復系統進行修復，由于細胞中DNA的不完全修復可能會引起控制產生目標性狀功能的遺傳片段發生改變，從而導致性狀功能發生改變[20-21]。一般認為出發菌株穩定時，選用致死率在90%以上菌株，以求得突變幅度較大的目標菌株[22]，因此試驗選擇處理時間為100 s，致死率為98.7%的誘變菌株。

2.3 高產酒精及酸釀酒酵母初篩

2.3.1 TTC培養基的篩選結果 TTC作為一種顯色劑，能對酵母的代謝產物發生顯色反應，并且通過反應顏色的深淺來判斷酵母中呼吸酶活力大小，從而判斷酵母產酒精能力的高低。通常情況下，產酒精能力越強的酵母菌株在TTC培養基上顯現的顏色越深。采用劃線法將39株誘變菌株接種到TTC培養基上，結果如表1所示，Y6-5、Y6-8、Y6-10、Y6-14、Y6-15、Y6-17、Y6-28、Y6-31、Y6-32、Y6-33、Y6-35，11株菌株顯色最為明顯，為深紅色，比出發菌Y6顯現的顏色更深，說明這11株酵母菌株在經過等離子體處理后，產酒精能力有所增強。而Y6-3、Y6-6、Y6-11、Y6-27、Y6-34、Y6-39，這6株酵母菌都和出發菌Y6顯色一致，為紅色，但為了進一步了解株菌的產酸能力是否提高，將篩選出的11株深紅色酵母菌進行溴甲酚綠培養基篩選試驗。

圖2 處理時間對Y6酵母菌致死率的影響

2.3.2 溴甲酚綠培養基的篩選 溴甲酚綠一般被用作酸堿指示劑，當pH值在3.8時，顯現出黃色；當pH值在5.4時，顯現出藍綠色。將溴甲酚綠加入培養基中，可以判斷酵母菌株產酸能力的強弱。將TTC篩選出的17株菌株接種到溴甲酚綠培養基中，結果如表2所示，Y6-8、Y6-10、Y6-14、Y6-15、Y6-28、Y6-31、Y6-33這7株誘變菌株在溴甲酚綠培養基上的黃色圈均大于出發菌株Y6，可以初步判斷這7株突變菌株的產酸能力強于出發菌株。

表1 39株誘變酵母菌株TTC培養基篩選結果?

? “++++”表示深紅色；“+++”表示紅色；“++”表示粉色；“+”表示淺粉色；“-”表示無色。

表2 11株誘變酵母菌株溴甲酚綠培養基篩選結果

2.3.3 杜氏小管篩選 將上步篩選出的7株誘變菌株接種在裝有杜氏小管的試管中，當12 h時，菌株Y6-15和Y6-33的杜氏小管中產氣較多，其他誘變菌株均無明顯反應；當24 h時，菌株Y6-8中的杜氏小管充滿了氣體，并且杜氏小管浮在液面上，Y6-31和Y6-33與出發菌株Y6的產氣能力相同，在杜氏小管中有4/5的氣體，其他菌株的產氣能力相對較弱；當36 h時，除Y6-15和Y6-28之外，其他菌株都將杜氏小管中充滿氣體；在36，48 h時，所有菌株都將杜氏小管中充滿氣體。綜上所述，可以判斷7株誘變菌株的起酵能力為：Y6-8>Y6-33=Y6-31>Y6-15>Y6-10>Y6-28，因此初步確定Y6-8為目標菌株。

2.4 誘變菌株復篩

將7株菌株分別接種到葡萄汁后，其產酒精產酸情況如表4所示，與出發菌株相比，誘變菌株的產酸產酒精能力明顯增強，與初篩結果一致，說明ARTP處理能夠改變菌株的某些基因，從而改變菌株的功能。6株菌株產酒精能力依次為：Y6-8>Y6-31>Y6-15>Y6-33>Y6-10>Y6-28；6株突變菌株的產酸能力也存在一定的差別，其能力強弱依次為：Y6-8>Y6-15>Y6-31>Y6-33>Y6-28>Y6-10，但菌株產主要有機酸種類基本一致，為L-乳酸、酒石酸以及蘋果酸。由此可以猜測菌株經過ARTP處理后，雖然產酸能力的強弱得到了改變，但產主要有機酸種類不會發生改變。GB 15037—2006 《葡萄酒》中限定葡萄

表3 6株誘變酵母菌株杜氏小管60 h間產氣情況?

? “+++++”表示杜氏小管中充滿氣體；“++++”表示杜氏小管中充滿4/5的氣體；“+++”表示杜氏小管中充滿1/2的氣體；“++”表示杜氏小管中充滿1/3的氣體；“+”表示杜氏小管中充滿1/5的氣體；“-”表示杜氏小管中無氣體。

表4 6株誘變酵母菌株與出發菌株產酒精產酸情況

酒中揮發酸≤1.2 g/L，以上菌株均符合要求，因此，最終將Y6-8確定為目標菌株。

2.5 遺傳穩定性試驗

將突變菌株Y6-8培養5代，把每一代菌液接種到葡萄汁中發酵10 d，發酵液的酒精度和總酸分析結果見圖3。由圖3可知，第3代菌株產酒精能力最強為12.7%vol，第5代菌株產酸能力最強為2.26 g/L。雖然5代菌株的產酸和產酒精能力存在微小差距，產酸能力都維持在2.2 g/L左右且揮發酸含量在0.33 g/L左右，產酒精能力都維持在12%vol以上。由此可以表明，突變菌株Y6-8的高產酸和酒精性能可以穩定的遺傳。

圖3 Y6-8連續5代產酒精和產酸情況

3 結論

本研究以葡萄表面篩選出的釀酒酵母菌株Y6為出發菌，通過單因素試驗確定ARTP處理時間的最佳時間。通過TTC培養基試驗、溴甲酚綠培養基試驗以及杜氏小管試驗對突變菌株進行初步篩選，最后再經葡萄汁發酵試驗和遺傳穩定性試驗確定目標菌株為Y6-8，該突變菌株的產酸能力和產酒精能力較出發菌株Y6分別提高了214.93%和28.13%，該菌株在一定程度上可以解決新疆葡萄酒糖高酸低的現狀，提高新疆葡萄酒品質。同時說明ARTP誘變能夠高效率改變菌株的發酵性能。但該研究僅將誘變菌株Y6-8在紅葡萄酒發酵過程中給予驗證，在白葡萄酒的生產中還有待進一步驗證。