全麥發(fā)酵面團(tuán)菌群結(jié)構(gòu)分析及對風(fēng)味物質(zhì)的影響

尚 英 熊榮園 -

(南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 南充 637131)

一直以來，精細(xì)化飲食是中國的主流飲食文化，小麥在精細(xì)化加工過程中，如麩皮、皮層、胚芽等具有營養(yǎng)價值的物質(zhì)均被轉(zhuǎn)移到飼料等副產(chǎn)品中，造成營養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)[1]。但隨著現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)的研究，越來越認(rèn)識到全谷物非精細(xì)化飲食可以有效地預(yù)防多種慢性疾病的發(fā)生，如提高食品中的全谷物含量可有效降低糖尿病的發(fā)病率[2]。小麥粉及其制品作為中國的主食之一，對全麥粉的成分研究[3]指出，全麥粉中含有豐富的三甲基甘氨酸和膽堿，長期服用全麥粉可以有效預(yù)防新生兒的神經(jīng)血管缺陷問題，同時可減少成年人的高血壓和心血管疾病發(fā)病概率[4]。《中國居民膳食指南(2016)》也提倡人們將全谷物作為膳食重要組成成分[5]。全麥面粉保留了天然小麥的全部成分，與精制面粉相比，可提供更多的B族維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)成分及有益健康的植物化學(xué)物[6-7]。全麥飲食是一種安全有效的健康生活方式[8]。

目前國內(nèi)的發(fā)酵面粉制品主要采用精制面粉，且多數(shù)采用單一的商業(yè)酵母菌發(fā)酵[9-10]。發(fā)酵速度快，但風(fēng)味和口味比較單一[11-12]。歐美國家在使用全麥面粉代替精細(xì)化面粉制作烘焙食品的研究較為深入，而國內(nèi)關(guān)于應(yīng)用全麥面粉開發(fā)烘焙食品的研究剛起步[13]。如將全麥發(fā)酵食品有效利用起來，不僅可以提高面制品的經(jīng)濟(jì)附加值，同時可以有效提高人們的合理膳食水平，保證了人們的健康[14-15]。本研究擬以四川南充高坪區(qū)域特色“老面”作為傳統(tǒng)發(fā)酵劑和全麥面粉制成面團(tuán)，對發(fā)酵面團(tuán)中的酵母菌、乳酸菌及其他細(xì)菌進(jìn)行分離純化與鑒定，采用宏基因組學(xué)的方法解析該面團(tuán)中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，并確定其核心菌屬/菌種。同時將市售商業(yè)發(fā)酵劑與全麥面粉制成面團(tuán)，比較2種面團(tuán)的風(fēng)味物質(zhì)含量。旨在為全麥面粉的應(yīng)用提供理論支持，同時為全麥發(fā)酵食品的研究和開發(fā)提供依據(jù)，以期為改善工業(yè)化全麥發(fā)酵面團(tuán)的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

去離子水：校食品檢測與飼料監(jiān)測中心制備；

全麥面粉：市售一級，山東德運(yùn)面粉有限公司；

傳統(tǒng)發(fā)酵劑：老面，校學(xué)生食堂提供；

商業(yè)酵母菌劑：安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。

1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：美國西格瑪奧德里奇有限公司；

膠回收試劑盒：北京天根生物科技公司；

DNAPolymerase、dNTPs、10×Taqbuffer、Taq酶、Tris-飽和酚、溶菌酶、分子生物學(xué)試劑：大連寶生物Takara有限公司；

其他試劑：分析純，吳江新源化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

微量分光光度計：NanoDrop2000型，美國Thermo Fisher公司；

水平電泳系統(tǒng)：JY-SPCT型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；

凝膠成像儀：WD-9403S型，北京市六一儀器廠；

第二代高通量測序儀：Miseq型，美國Illumina公司；

恒溫培養(yǎng)箱：SHP-180型，杰瑞爾電器有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀：5977A型，美國安捷倫科技有限公司；

去離子純水機(jī)：Eco-Q型，上海和泰儀器有限公司；

醒發(fā)箱：SMF-32B型，無錫勝麥機(jī)械有限公司；

冷凍離心機(jī)：5415R型，德國Eppendorf公司；

超低溫冰箱：DW-86L959型，青島海爾公司；

超凈工作臺：SJ-CJ-2F型，蘇州蘇潔醫(yī)療公司。

1.4 方法

1.4.1 面團(tuán)的制備

(1) 工藝流程

調(diào)制面團(tuán)(面粉500 g，純凈水240 mL)→和面(20 min)→成型→一次醒發(fā)(相對濕度85%，36 ℃，20 min)→揉制(10 min)→二次醒發(fā)(相對濕度85%，36 ℃，30 min)

(2) 操作要點(diǎn)：將全麥面粉和傳統(tǒng)老面放入和面缸中，使用攪拌機(jī)進(jìn)行和面，先慢速攪拌10 min，再快速攪拌10 min，和面后應(yīng)達(dá)到面筋充分?jǐn)U展，表面無斷裂痕跡，面團(tuán)手感柔和，表面光潔。通過2次充分醒發(fā)提高面團(tuán)的發(fā)酵完整度，同時考慮避免出現(xiàn)過度發(fā)酵的情況出現(xiàn)。

商業(yè)酵母發(fā)酵面團(tuán)采用全麥面粉與商品化酵母菌劑混合后發(fā)酵的方法，具體加工流程同傳統(tǒng)老面發(fā)酵流程。

1.4.2 面團(tuán)樣品的采集、貯藏及預(yù)處理 從實(shí)驗(yàn)室溫箱中取出傳統(tǒng)發(fā)酵完全的全麥面團(tuán)樣品，無菌稱取100 g左右的面團(tuán)，中心位置、中間層和表面分別挖取10 g面團(tuán)放入錐形瓶，重復(fù)以上操作5次，每次采樣的面團(tuán)為測序目標(biāo)樣品，依次命名為1～5號樣品。向采集的面團(tuán)中加入190 mL無菌生理鹽水，搖床內(nèi)持續(xù)搖動20 min，使面團(tuán)充分吸收水分并分散均勻。從分散液中取5 mL液體裝入15 mL無菌離心管中，-4 ℃冰箱備用。

1.4.3 面團(tuán)總基因組提取 將1.4.2制備的分散液(在冰箱的貯藏時間不超過48 h)于4 ℃，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀于4 ℃冰箱中備用。采用試劑盒法提取總基因組，具體方法參考試劑盒說明書。采用1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，60 min)進(jìn)行提取基因組檢測，電泳結(jié)果顯示條帶完整，測定濃度后寫明樣品名稱為傳統(tǒng)面團(tuán)和商業(yè)面團(tuán)，放入-20 ℃冰箱，準(zhǔn)備測序。

1.4.4 MiSeq宏基因組測序及生物信息學(xué)分析 以1.4.3中提取的細(xì)菌總基因組為模板，擴(kuò)增V3～V4區(qū)(250 bp左右)的基因片段。引物擴(kuò)增序列為：GGYAAGNGGG GYDTA；TACAATCTATCVGGGTCN。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳切膠回收后，立即使用Illimina MiSeq PE 250進(jìn)行高通量測序。測序完成后，先進(jìn)行質(zhì)控去除低質(zhì)量序列。使用Flash軟件進(jìn)行序列拼接，得到分析所用總序列后進(jìn)行聚類，得到各樣品的總OTU，采用Qiime軟件進(jìn)行分析，分析內(nèi)容包括：繪制稀疏曲線、Alpha多樣性分析、科水平和種水平的物種多樣性分布統(tǒng)計。

1.4.5 面團(tuán)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定 稱取5 g面團(tuán)于頂空樣品瓶(15 mL)中，60 ℃水浴加熱35 min。通過SPME針頭將萃取頭伸入樣品瓶頂空部分，萃取25 min，轉(zhuǎn)至氣相色譜儀，240 ℃解析7 min。色譜條件：色譜柱35 m×0.22 μm×220 μm，進(jìn)樣口最終溫度240 ℃，起始溫度50 ℃，靜止3 min，以3 ℃/min加熱至55 ℃，再以4 ℃/min 加熱至100 ℃，之后以5 ℃/min加熱到230 ℃，靜止3 min，載氣He，保持0.5 mL/min流量體積，采用不分流模式，2 μL進(jìn)樣量。質(zhì)譜條件：使用電子轟擊離子源(EI)為電離方式；接口溫度240 ℃；保持離子源溫度190 ℃；電子能量60 eV；掃描范圍m/z41～488。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 7進(jìn)行處理，采用One-Way ANOVA進(jìn)行顯著性分析，使用Origin 2017進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)味物質(zhì)組成

由表1可知，在全麥傳統(tǒng)發(fā)酵面團(tuán)和全麥商業(yè)發(fā)酵面團(tuán)中分別檢測出45，36種風(fēng)味物質(zhì)，其中包括：芳香、酸、酯、酮等8類。數(shù)量上，2種面團(tuán)中烴類的含量最多，其次為醛類和醇類物質(zhì)，醚類物質(zhì)最少。總含量上，傳統(tǒng)發(fā)酵面團(tuán)的風(fēng)味物質(zhì)含量最多，比商業(yè)發(fā)酵面團(tuán)多9種，烴類物質(zhì)為含量差異最多的物質(zhì)。風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生與微生物的作用有關(guān)，其中全麥面粉中的糖類物質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵，可以產(chǎn)生酸和醇類化合物，而產(chǎn)生的酸和醇類化合物可進(jìn)一步反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物；微生物通過醛醇縮合反應(yīng)、氨基酸的Strecker降解和高級醇氧化都可產(chǎn)生多種羰基化合物。

表1 風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果?

? “—”表示未檢測到。

2.2 宏基因組法分析菌群結(jié)構(gòu)

在科分類水平上(圖1)，所有測序樣品中的主要細(xì)菌科為乳酸菌科，所占比例均為90%以上；第二為醋酸桿菌科，所占比例為5%左右；此外，所有樣品中還含有芽孢桿菌科(1%)和明串珠菌科(1%)的細(xì)菌。屬分類水平分析結(jié)果如圖2所示，5個樣品中含量最高為乳桿菌屬，達(dá)88%以上，其他含量較高的菌屬分別為魏氏菌屬、醋桿菌屬、明串珠菌屬等。通過菌群分類研究結(jié)果顯示，在全麥發(fā)酵面團(tuán)樣品中含量最高的菌群主要是乳酸桿菌，該菌可能在全麥面團(tuán)的發(fā)酵過程中扮演重要的角色。

2.2 乳酸菌種的分類水平分析

上述研究已證實(shí)乳酸菌為全麥傳統(tǒng)發(fā)酵面團(tuán)中主要的細(xì)菌核心菌群，乳酸菌種的含量情況如圖3所示，樣品中分別含有植物乳桿菌、短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、舊金山乳桿菌、德氏乳桿菌、面包乳桿菌，其中含量最高的菌種為短乳桿菌，達(dá)35%～39%，其次為發(fā)酵乳桿菌，達(dá)21%～23%，植物乳桿菌和舊金山乳桿菌含量相對接近，均在10%～16%。

圖 1 科水平的物種分布情況

圖2 屬水平的物種分布情況

圖3 乳酸菌種水平分布情況

3 結(jié)論

從試驗(yàn)可以看出，傳統(tǒng)發(fā)酵全麥面團(tuán)除酵母菌外還含有較多的乳酸菌，用傳統(tǒng)發(fā)酵菌劑發(fā)酵全麥面團(tuán)比用商業(yè)酵母菌劑在風(fēng)味物質(zhì)的總量以及種類方面較優(yōu)，表明傳統(tǒng)發(fā)酵菌株對全麥面制品的風(fēng)味更有利。可能是商業(yè)酵母菌劑只有酵母菌，使得發(fā)酵的全麥面團(tuán)風(fēng)味物質(zhì)種類較少。而傳統(tǒng)發(fā)酵菌劑含有的乳酸菌，使全麥面團(tuán)酸化產(chǎn)生多種有機(jī)酸，有利于醇、酮、醛和酯等風(fēng)味物質(zhì)的生成。隨著全社會對人群健康的重視，全麥發(fā)酵面團(tuán)的研制，能夠帶來一定的健康價值和經(jīng)濟(jì)價值，同時還具有廣泛的應(yīng)用價值。后續(xù)將對全麥發(fā)酵面團(tuán)的傳統(tǒng)發(fā)酵菌劑的用量、發(fā)酵條件和制作工藝對風(fēng)味物質(zhì)的影響進(jìn)行重點(diǎn)研究，以便更好地為全谷物飲食的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。