丙泊酚通過下調BNIPL-2抑制結腸癌增殖的研究

薛震宇 張磊 姜虹

結腸癌的發病率每年都在持續增加。2015年，結腸癌的發病率和死亡率在中國所有惡性腫瘤中排名第五［1］。結腸癌是全球癌癥相關死亡的第四大原因，每年大約有140萬的新發病例，并且2012年死亡人數將近70萬［2］。雖然目前臨床上已有的治療手段包括手術、化療和分子靶向治療等，在一定程度上改善了患者的生活質量，但整體而言結腸癌患者的預后仍然較差［3］。因此，迫切需要開發更有效的治療方法。

腫瘤細胞的遷移和侵襲在癌癥轉移中起關鍵作用。BNIPL-2（Bcl-2 /腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白-2）可與Cdc42GAP相互作用并抑制Cdc42GAP 對Cdc42的GAP活性［4］。Rho家族的GTP酶Cdc42可以控制肌動蛋白細胞骨架的動力學［5-6］。細胞遷移與肌動蛋白細胞骨架的重組相關，并引發細胞形態的改變。說明BNIPL-2的過表達可能增加細胞侵襲并促進細胞遷移。

丙泊酚（2，6-二異丙基苯基）是麻醉誘導和維持期間廣泛使用的藥劑。最近的發現表明，麻醉可以在圍手術期誘發代謝、炎癥和免疫學變化［7］。最近已經揭示丙泊酚通過抑制細胞活力和癌細胞的侵襲能力對一些惡性腫瘤發揮抗腫瘤作用［8-9］。然而，其對癌細胞增殖的作用機制尚不清楚。因此，在本研究中，我們使用SW480結腸癌細胞研究了丙泊酚對癌細胞增殖作用的影響，并探討了其潛在機制。

資料與方法

一、研究對象

應用TCGA分析BNIPL-2表達差異和相關基因轉錄組譜的臨床結腸癌樣本中BNIPL-2相關調控信號通路，來源于TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）。

根據BNIPL-2的表達水平，對患者進行分組，分為高表達組和低表達組。為了檢測臨床惡性腫瘤階段，相關信號傳導，CRC患者存活率和BNIPL-2表達之間的關系，我們以BNIPL-2表達水平的中位數為分界線將CRC組織分為高表達組和低表達組。BNIPL-2表達高于中位數的患者被分為高表達組。BNIPL-2表達低于中位數的患者分為低表達組。

二、細胞實驗

（一）細胞培養、細胞模型

從本院中心實驗室獲得的CRC細胞系SW480，在含有10% FBS（Gibco公司，美國）的DMEM（Hyclone公司，美國）中培養。將細胞在37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。丙泊酚干預細胞，在麻醉維持期間，丙泊酚的濃度范圍為5至50 μM［10］。在該研究中，丙泊酚分別以濃度梯度（1，5，10，20 μg/mL）施用于細胞4 h。從SW480細胞中分離總RNA，并通過逆轉錄PCR試劑盒（Takara，Japan） 合 成cDNA。 從cDNA擴 增BNIPL-2 mRNA的CDS序列并插入Fugw載體。通過使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher公司，美國）將載體轉染到細胞中。

（二）CCK-8檢測細胞增殖

將處于對數生長期的SW480結直腸癌細胞用胰酶消化后，以5×103個/孔細胞接種于96孔培養板中，待細胞貼壁后分別加入DMSO和不同濃度的丙泊酚（濃度分別為1，5，10，20 μg/mL），37 ℃，5% CO2的培養箱中培養4 h后，每孔加入100 μL培養基和10 μL CCK-8檢測試劑，繼續孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處OD值。設3個復孔。

（三）qRT-PCR

使用RNAiso Plus（TaKaRa公司，日本）根據說明書從CRC細胞中分離總RNA。使用M-MLV逆轉錄酶（Invitrogen公司，美國）將總共1 μg RNA轉化為cDNA。使用SYBR Green（Enzynomics公司，韓國）分析相對基因表達。進行實時PCR并使用CFX分析數據（Bio-Rad公司，美國）。

三、統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理。組間的比較用方差分析，組與組之間的比較用LSD-t檢驗。P＜0.05被認為差異具有統計學意義。

結 果

一、BNIPL-2在結腸癌組織中上調并且與預后不良相關

為了檢測BNIPL-2表達是否與結腸癌相關，我們分析了43個正常組織樣本和來自TCGA的459個腫瘤樣本中BNIPL-2的表達水平，發現與正常組織相比結腸癌樣本中BNIPL-2水平顯著上調（圖1A）。Kaplan-Meier生存曲線用于分析不同水平的BNIPL-2表達是否與結腸癌患者的預后相關。我們將患者分為兩組，BNIPL-2低表達和高表達組，發現與高表達結腸癌患者相比，BNIPL-2表達較低的患者擁有較高的存活率。此外，BNIPL-2低表達患者的5年生存率與BNIPL-2高表達患者相比生存率顯著提高（圖1B）。

圖1 TCGA分析。1A：與正常組織相比，腫瘤樣本中的BNIPL-2表達水平較高；1B：BNIPL-2高表達組的生存率低于低表達組

二、BNIPL-2的高表達與CRC的惡性階段相關

因為BNIPL-2高表達與預后不良的關系，我們假設BNIPL-2表達與惡性特征相關。我們發現在Ⅳ期患者的BNIPL-2水平表達較高，而在Ⅱ期和Ⅲ期BNIPL-2的表達水平較低（圖2A）。我們進一步分析了TNM分期，發現與低表達組相比，BNIPL-2表達較高的患者在M1期更多（圖2B）。BNIPL-2的表達與N分期分類之間沒有顯著差異（圖2C）。然而，T分期分析顯示，與低表達結腸癌組織相比，BNIPL-2高表達的癌組織常處于T4期（圖2D）。

三、BNIPL-2促進CRC細胞系SW480的增殖

我們通過基因集富集分析（GSEA）檢測了與CRC轉錄組譜中BNIPL-2表達相關的腫瘤發生和發育相關調控途徑，發現BNIPL-2高表達組織中細胞遷移相關信號通路被激活。SW480細胞中BNIPL-2的異位表達上調細胞周期蛋白D，細胞周期蛋白E的表達，下調細胞周期抑制因子P21的表達（圖3）。

四、丙泊酚對SW480結腸癌細胞增殖作用的影響

CCK-8結果顯示，經過濃度分別為1 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL丙泊酚處理4 h后，結腸癌SW480細胞增殖受到明顯抑制，呈濃度依賴性，各濃度組與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01，見圖4）。提示丙泊酚能抑制SW480細胞增殖。

五、通過不同濃度的丙泊酚調節BNIPL-2基因的表達

為了闡明丙泊酚抑制CRC細胞增殖的機制，通過qRT-PCR分析SW480細胞中BNIPL-2基因的表達（P＜0.05，見圖5）。BNIPL-2隨丙泊酚的濃度升高而降低。提示丙泊酚能下調BNIPL-2的表達水平。

圖2 BNIPL-2在結腸癌組織中的表達情況。2A：在IV期BNIPL-2表達水平增高，而在II期和III期BNIPL-2表達水平較低；2B：與低表達BNIPL-2的癌組織相比，BNIPL-2高表達的癌組織在M1更多；2C：BNIPL-2的表達與N分期分類之間沒有顯著差異；2D：與低表達結腸癌組織相比，BNIPL-2高表達的癌組織常處于T4期

圖3 qRT-PCR檢測細胞周期蛋白。qPCR顯示SW480細胞中BNIPL-2上調細胞周期蛋白D1，細胞周期蛋白E1的表達，下調細胞周期抑制因子P21的表達

討 論

丙泊酚作為最廣泛使用的靜脈麻醉藥之一，在臨床麻醉中被廣泛應用于成年人、兒童、老人等手術中并發揮了多重優勢［10-11］。除了麻醉效果外，異丙酚還具有多種非麻醉作用，如神經保護［12］，抗氧化［13］，抗焦慮［14］和抗腫瘤［15-16］等。

在本研究中，我們使用了從TCGA獲得的459名腫瘤患者和43名對照患者，并將它們分為低BNIPL-2和高NIPL-2表達組。Kaplan-Meier曲線分析表明，BNIPL-2高表達與結腸患者的生存率呈負相關。在結腸癌組織中BNIPL-2上調并且與預后不良相關。

之后，本研究提供了證據表明丙泊酚對結腸癌細胞增殖的抑制作用，腫瘤細胞的細胞增殖能力與丙泊酚濃度呈負相關。隨著丙泊酚的濃度升高，腫瘤細胞的增殖能力顯著下降。同時丙泊酚可以調節BNIPL-2的水平降低，q-PCR分析表明丙泊酚呈濃度依賴性抑制BNIPL-2的表達水平。我們在體外細胞模型中證實了這些結果。以前的研究表明丙泊酚可以減少許多癌癥的轉移和進展，包括結腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌和宮頸癌［17-21］。然而，丙泊酚在癌細胞中是否通過BNIPL-2的作用仍然知之甚少。在這項研究中，我們證明了這一點。我們的數據還證實丙泊酚以劑量依賴性方式降低SW480結腸癌細胞的增殖活性。

綜上，本研究進一步探討了丙泊酚通過下調BNIPL-2的表達對結腸癌患者的生存率的改善，并且能夠抑制腫瘤細胞的增殖作用。故認為BNIPL-2參與并調控結腸癌細胞的增殖。但目前確切的作用機制與信號通路等問題仍將進一步研究。

圖4 CCK-8檢測不同濃度丙泊酚對細胞增殖的影響；表明經過濃度分別為1，5，10，20 μg/mL丙泊酚處理，SW480細胞增殖受到明顯抑制，呈濃度依賴性

圖5 qRT-PCR分析SW480細胞中BNIPL-2基因的表達。表明BNIPL-2 表達水平隨丙泊酚的濃度呈依賴性下降