人口腔鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞中microRNAs差異表達(dá)研究

胡雪剛 邱在玲 曾建釵 林詩晗 樊麗娜 呂紅兵 傅升

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是最常見的頭頸部惡性腫瘤，位列全身常見腫瘤的第6 位[1]，侵襲性較高、晚期診斷、低治療反應(yīng)和轉(zhuǎn)移是造成5 年生存率低的主要原因[2]。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是腫瘤組織中一小部分細(xì)胞群，是腫瘤對化療藥物耐受性、腫瘤轉(zhuǎn)移和進展的主要調(diào)節(jié)者[3]。微小RNA(miRNAs)是19-23nt的非編碼RNA，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)對許多生物過程至關(guān)重要[4]，在癌癥中其表達(dá)的改變可以作為疾病潛在的生物標(biāo)志物[5]。miRNAs能夠介導(dǎo)和調(diào)控腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞信號通路的能力，但是他們的確切機制還待研究和闡明。

本實驗主要探討口腔鱗癌細(xì)胞系TCA-8133中CD133+細(xì)胞是否具有CSCs的特征，以及篩選口腔鱗癌CSCs相關(guān)miRNAs的表達(dá)譜，篩選出差異miRNAs，并對其進行生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)公司, 日本)；胎牛血清(Hyclon,美國)、胰蛋白酶(Gibco，美國)； 酶標(biāo)儀(DU-600型,Beckman公司, 美國)；I型膠原酶、 DMEM、dispase II酶(Sigma，美國)；鼠抗人CD133單克隆抗體(R&D systems，美國)；結(jié)晶紫(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；免疫磁珠(Miltenyi Biotec，德國)；TruSeq Small RNA Sample Prep Kit(Illumina，美國)；Transwell 小室(BD Biosciences,美國)。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

人口腔鱗癌細(xì)胞系TCA-8113(購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)復(fù)蘇后用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 細(xì)胞生長達(dá)70%～80%融合時以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 利用免疫磁珠分選CD133+TCA-8133細(xì)胞

取對數(shù)生長期的TCA-8113，鼠抗人CD133單克隆抗體2.5 μg/106細(xì)胞標(biāo)記；每107細(xì)胞加入20 μl FcR blocking、 50 μl running buffer，充分混勻后4 ℃孵育15 min，加入4 ml buffer清洗細(xì)胞；再次將細(xì)胞與20 μl免疫磁珠、 80 μl running buffer混合，然后在4 ℃下在黑暗中孵育15 min，清洗細(xì)胞后加500 μl buffer重懸，置LS分選柱中，磁性標(biāo)記的細(xì)胞保留在磁性柱中，而未標(biāo)記的細(xì)胞直接通過磁性柱。將 CD133+和CD133-TCA-8133洗下并收集到離心管中進行離心。采用CCK-8法檢測 CD133+和 CD133-TCA-8113 細(xì)胞的增值能力，繪制細(xì)胞增殖曲線，實驗重復(fù)3 次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中CD133的表達(dá)

取2×106個免疫磁珠法分選前后的口腔鱗癌TCA-8113細(xì)胞重懸于160 μl PBS 緩沖液中，分別加入熒光素標(biāo)記的鼠抗人CD133抗體, 對照組加入同型鼠IgG抗體, 根據(jù)制造商的說明書進行操作, 最后將樣品上機檢測CD133的陽性率。

1.5 平板克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的CD133+和CD133-TCA-8113以1 000 個細(xì)胞/孔接種于6 孔板中，每組3 個復(fù)孔。置于37 ℃、 5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周， 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，隨后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，計數(shù)可見菌落的數(shù)量，以直徑>1 mm(50 個細(xì)胞/克隆)時計數(shù)克隆數(shù)，重復(fù)試驗3 次。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測

使用具有8 μm 孔徑聚碳酸酯濾膜的Transwell小室進行侵襲測定。在測定之前，將瓊脂包被在上室中過夜。用無血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×105個細(xì)胞/小室的細(xì)胞密度在上室中，用4%多聚甲醛固定侵入的細(xì)胞10 min，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在倒置顯微鏡下觀察，實驗重復(fù)3 次。

1.7 二代測序技術(shù)檢測miRNAs表達(dá)譜

用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit根據(jù)制造商推薦的流程，構(gòu)建miRNAs測序文庫，待測miRNAs文庫在cBot上完成簇類生長，將流通池轉(zhuǎn)移到HiSeq 2000型基因測序儀上，按照標(biāo)準(zhǔn)流程二代測序及分析。

1.8 miRNAs靶基因預(yù)測及基因功能生物信息分析

使用TargetScan (http://www.tagetscan.org) 和miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do) 軟件預(yù)測差異miRNAs的的靶基因。使用DAVID 6.7功能注釋工具(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對差異miRNAs的所有靶基因進行GO和KEGG通路富集分析。利用DAVID將GO注釋分成3 個類別，包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。KEGG通路分析使用(http://www.genome.jp/kegg/),其中P<0.05。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CD133+和CD133-TCA-8113細(xì)胞的分離培養(yǎng)

培養(yǎng)免疫磁珠篩選后CD133表達(dá)陽性的TCA-8113細(xì)胞，為呈均一的多角形上皮樣細(xì)胞,鑲嵌狀排列,少數(shù)為圓形,多核巨細(xì)胞和巨核細(xì)胞,CD133-和CD133+TCA-8113 細(xì)胞形態(tài)類似，沒有顯著差異。采用CCK-8法檢測 CD133+或CD133-TCA-8113 細(xì)胞的增值能力，結(jié)果顯示， 第4～7 天，CD133-TCA-8113 的A值低于CD133+TCA-8113(P<0.05)(圖 1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133的表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，CD133蛋白在口腔鱗癌細(xì)胞系TCA-8113中低表達(dá)，CD133+細(xì)胞百分比為(16.57±0.49)%。TCA-8113 細(xì)胞系經(jīng)免疫磁珠分選后進行流式分析，結(jié)果顯示，純化后CD133+TCA-8113 細(xì)胞的百分比可達(dá)(91.10±0.35)%(圖 2)。

2.3 CD133+TCA-8113細(xì)胞的克隆形成能力明顯增強

CD133+TCA-8113細(xì)胞在超低吸附板中培養(yǎng)2 周后，大部分細(xì)胞形成了細(xì)胞克?。欢鳦D133-TCA-8113細(xì)胞細(xì)胞克隆數(shù)量相對較少， 部分細(xì)胞趨于崩解或凋亡。在倒置顯微鏡下計數(shù)，CD133+和 CD133-TCA-8113細(xì)胞克隆數(shù)分別為246.7±12.02和172.3±2.848(P=0.04)(圖 3)。

圖 1 磁珠分選后CD133+和CD133-TCA-8113細(xì)胞光鏡下的形態(tài)和增殖能力

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Fig 1 Morphology and proliferation capacity of CD133+ and CD133-TCA-8113 cells

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圖 2 免疫磁珠分選前(A) 后(B) TCA-8113細(xì)胞中CD133+TCA-8113細(xì)胞的比例

Fig 2 Percentages of CD133+TCA-8113 in TCA-8113 before (A) and after (B) immunomagnetic bead cell sorting

圖 3 CD133+和 CD133-TCA-8113細(xì)胞的克隆形成能力

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Fig 3 The colony formation abilities of D133+ and CD133-TCA-8113 cells

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2.4 細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果 利用Transwell小室侵襲實驗，研究CD133+和 CD133-TCA-8113細(xì)胞的侵襲能力。實驗結(jié)果顯示，CD133+和CD133-TCA-8113細(xì)胞侵襲數(shù)分別為576.7±33.83和206.3±18.89(P=0.01)(圖 4)。

圖 4 CD133+和 CD133-TCA-8113細(xì)胞的侵襲能力檢測

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Fig 4 Invasion of D133+ and CD133-TCA-8113 cells

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2.5 CD133+和 CD133-TCA-8113細(xì)胞中miRNAs表達(dá)譜差異分析

用R package DESeq2(Version 1.6.1)軟件，二代測序顯示CD133+與 CD133-TCA-8113細(xì)胞共有1 505 個 miRNAs 的表達(dá)存在差異。其中差異倍數(shù)>1.5，P<0.05的miRNAs共有12 個： 2 個miRNAs在CD133+TCA-8113細(xì)胞中高表達(dá)，分別是has-miR-1248, has-miR-1273g-3p， 10 個miRNAs低表達(dá)，分別是has-miR-3651, has-miR-188-5p, has-miR-1285-1, has-miR-6737-3p, has-miR-663a, has-miR-2276-3p, has-miR-4466, has-miR-494-3p, has-miR-1290, has-miR-6889-3p(圖 5)。

2.6 差異表達(dá)miRNAs靶基因的預(yù)測

為提高預(yù)測的特異性，本研究采用miRanda和RNAhybrid進行靶基因預(yù)測，其中上調(diào)的2 個miRNAs: hsa-miR-1248、 hsa-miR-1273g-3p, 分別注釋到5 個和1 194 個靶基因， 下調(diào)的10 個miRNAs中有2 個沒有注釋到靶基因，其余8 個分別注釋到27～861 個靶基因不等。

2.7 差異表達(dá)miRNAs靶基因注釋

利用DAVID進行GO功能注釋和KEGG通路分析，GO注釋富集分析結(jié)果(圖 6)。細(xì)胞組成注釋，靶基因顯著富集于細(xì)胞、細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間連接等。分子功能注釋，靶基因顯著改變轉(zhuǎn)錄激活因子、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶和泛素蛋白連接酶的活性，以及DNA、蛋白質(zhì)、生長因子的結(jié)合。生物過程注釋，靶基因與血管形態(tài)發(fā)生、干細(xì)胞分化、上皮細(xì)胞的增殖等涉及發(fā)育與轉(zhuǎn)錄的一系列生物學(xué)過程。在KEGG通路富集分析中， 結(jié)果主要集中在癌癥途徑、 Wnt信號途徑、FC受體信號途徑、TRK信號途徑、氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)上皮增殖途徑等信號通路(P<0.05)(圖 6)。

圖 5 CD133+和 CD133-TCA-8113差異表達(dá)miRNAs火山圖(A)、聚類分析圖(B)

Fig 5 The volcano plot(A) and cluster analysis(B) of the differential miRNAs in CD133+ and CD133-TCA-8113

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌與廣泛的危險因素的關(guān)聯(lián)以及不可預(yù)測的治療結(jié)果使得其成為治療最復(fù)雜的癌癥之一[6]。盡管多種方法聯(lián)合治療，OSCC患者的5 年生存率在過去的40 年未超過50%[6-7]。越來越多的證據(jù)表明，miRMAs 可以作為癌癥診斷和預(yù)后標(biāo)志物[8]，CSCs 具有獨特性的促進治療進展和轉(zhuǎn)移的能力[9],從而為CSCs的靶向治療提供新的途徑。

A: 細(xì)胞組成; B: 分子功能; C: 生物過程

本研究通過二代測序獲得口腔鱗癌CSCs的miRNAs特異性表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與口腔鱗癌細(xì)胞比較，miRNAs在口腔鱗癌CSCs中的表達(dá)存在明顯差異。其中，差異在1.5倍以上的miRNAs有12 個， 10 個miRNAs在口腔鱗癌CSCs中低表達(dá)，結(jié)果提示差異性的miRNAs可能在口腔鱗癌CSCs的分化以及抑制腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

目前已有大量的研究證實了miRNAs在多種腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，且較為深入。Bai等[10]發(fā)現(xiàn)miR-142-5p可以通過抑制PTEN來誘導(dǎo)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的干細(xì)胞樣特性。El Helou 等[11]研究表明miR-600沉默導(dǎo)致乳腺癌干細(xì)胞增殖，而其過表達(dá)會降低乳腺癌干細(xì)胞自我更新，導(dǎo)致體內(nèi)致瘤性降低。在沒有miR-600的情況下，WNT信號是有活性的并且促進自我更新，而miR-600的過表達(dá)抑制WNT的活性并促進乳腺癌干細(xì)胞分化，可能作為乳腺癌治療的潛在靶標(biāo)。Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)miR-145和宮頸癌干細(xì)胞多能性相關(guān)，且miR-145在宮頸腫瘤分化后的表達(dá)增加。miR-145過表達(dá)會抑制干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，以及降低腫瘤侵襲和集落形成能力，同時miR-145低表達(dá)的患者預(yù)后更好。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)miR-141的高表達(dá)可以抑制前列腺癌干細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。同時在口腔鱗癌干細(xì)胞的研究也證實了miRNAs的調(diào)控作用，Yu等[14]發(fā)現(xiàn)抑制miR-204可促進口腔鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞增殖，EMT性狀和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Ghosh等[15]研究表明miRNAs主要通過調(diào)節(jié)口腔鱗癌中的腫瘤干細(xì)胞和EMT在順鉑耐藥性中發(fā)揮重要作用。

本實驗研究結(jié)果表明，差異性的miRNAs與干細(xì)胞分化、血管生成、癌癥途徑、Wnt信號途徑等信號通路有關(guān)。Ries等[16]發(fā)現(xiàn)miR-3651水平的改變表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)有關(guān)。同樣Pellatt等[17]研究表明miR-3651在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與腫瘤進展和臨床預(yù)后的密切相關(guān)，在癌癥進展中起重要作用，可用作食管鱗狀細(xì)胞癌患者的獨立預(yù)后生物標(biāo)志物。Fang等[18]發(fā)現(xiàn)miR-188-5p在肝細(xì)胞癌進展中通過靶向FGF5發(fā)揮抑制腫瘤的作用，miR-188-5p可作為肝細(xì)胞癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。此外Zhang等[19]研究表明miR-188-5p通過靶向LAPTM4B表達(dá)從而抑制前列腺癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Huang等[20]發(fā)現(xiàn)miR-663a通過靶向HMGA2抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲。這與本研究中的靶基因功能預(yù)測分析相符，為OSCC的早期診斷和靶向治療提供重要基礎(chǔ)研究。miRNAs對口腔鱗癌干細(xì)胞的調(diào)控和作用機制需要更進一步的實驗來闡明。

本研究通過對口腔鱗癌CSCs的miRNAs表達(dá)譜檢測, 發(fā)現(xiàn)了多條表達(dá)改變的特異性miRNAs,為進一步研究miRNAs在口腔鱗癌CSCs中的功能及表達(dá)調(diào)控機制、為探索口腔鱗癌生物治療新的靶點尋找實驗參考。