抵當湯減鉤吻毒性的實驗研究

林慧敏 ，王婉瑩 ，王文義 ，廖華軍 ，李德森 ，吳水生

（1.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

鉤吻［Gelsemium elegans （Gardn.et Champ.） Benth.］又名斷腸草、野葛、大茶藥等，為馬錢科胡蔓藤屬植物，是世界著名的有毒植物。中醫對其早有記載與應用，《神農本草經》將其列為下品，主金瘡、乳痓、中惡風、咳逆上氣、水腫、殺鬼疰蠱毒。現代研究表明鉤吻具有抗腫瘤、鎮痛、增強免疫、促進造血等作用，特別在無成癮性鎮痛和抗腫瘤等方面具有明顯的優勢［1］。但鉤吻的毒性較大，且其治療量和中毒量非常接近，安全指數小，劑量不易控制，容易發生中毒反應，每年均不乏鉤吻中毒的臨床報道［2］，限制其臨床的廣泛應用。國內外學者通過多種途徑探索降低鉤吻不良反應的方法，均未從根本上解決鉤吻的毒性問題［3-5］。中醫對中藥的毒性研究歷史悠久，積累了許多寶貴經驗，其中應用方劑的藥物配伍佐制是藥物減毒增（存）效的有效方法之一。抵當湯是《傷寒論》中治療太陽蓄血證的良方，因此我們嘗試應用抵當湯中藥物的配伍佐制作用，通過小鼠急性毒性實驗觀察抵當湯是否對鉤吻具有減毒作用。結合課題組前期研究的羊血血清、血漿及血細胞對鉤吻減毒效應的實驗，發現羊血血漿具有減毒效應，而血清及血細胞無此功能；且鉤吻中毒后表現為呼吸減慢直至衰竭，靶器官在肺，故初步選擇觀察肺組織，以期了解鉤吻中毒與抵當湯解毒機制。

1 實驗材料

1.1 動物 健康昆明種6～8周齡小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g，由福建醫科大學實驗動物中心代購，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 試藥 鉤吻采自福建省龍巖市胡蔓藤種植基地；抵當湯（水蛭、大黃、虻蟲、桃仁）購自福建中醫藥大學國醫堂醫院，均經福建中醫藥大學黃澤豪老師鑒定。

1.3 儀器 FA20004N電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；RE-52型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-8型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WD-3000全自動血液分析儀（吉林維爾醫療器械有限公司）；KH-Q2016組織切片機（闊海醫療科技有限公司）；FY135中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 藥物制備

2.1.1 鉤吻提取液的制備 參照本課題組前期的提取方法［6-7］：稱取同一植株鉤吻粗粉適量，用5倍量的90%乙醇浸泡0.5 h，加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，收集2次提取液，減壓濃縮回收乙醇，至無醇味后，定容得到含生藥量為0.3 g／mL的鉤吻提取液，于4℃冷藏備用。

2.1.2 抵當湯醇提液的制備

2.1.2.1 抵當湯各藥材的提取 ① 大黃的提取：參考文獻［8］，稱取16 g大黃粉末，用5倍量的95%乙醇，加熱回流提取3次，第1次2 h，第2、3次1.5 h，過濾，合并3次提取液，減壓濃縮回收乙醇，至無醇味后，定容至1 g／mL，于4℃冷藏備用。② 桃仁的提取：參考文獻［9］，稱取桃仁飲片 2 g，加 6倍量水，水沸騰后，煎煮2次，每次30 min，過濾，合并2次提取液，減壓濃縮，定容至 1 g／mL，于 4℃冷藏備用。③ 水蛭的提取：參考文獻［10-11］，稱取16 g水蛭，用10倍量70%乙醇浸泡4 h，第1次回流提取2 h，第2、3次用8倍量的70%乙醇回流提取1.5 h，過濾，收集3次提取液，減壓濃縮回收乙醇，至無醇味后，定容至1 g／mL，于4℃冷藏備用。④虻蟲的提取：參考文獻［12］，稱取已去翅足的虻蟲1 g，先用30倍量的95%乙醇脫水2 h，過濾，再用30倍量的丙酮脫脂2 h，將已脫水脫脂的虻蟲放置過夜，干燥研磨，于30倍量的0.01 mol／L鹽水中，浸泡12 h連續3次，過濾，收集3次浸液，減壓濃縮，定容至1 g／mL，于4℃冷藏備用。

2.1.2.2 醇提液的制備 抵當湯組成：大黃三兩，水蛭三十個，虻蟲（去翅足）三十個，桃仁二十個，參考《傷寒論》原方的一次給藥量換算劑量為：大黃16 g，桃仁 2 g，水蛭 16 g，虻蟲 1 g［13］。將上述大黃、桃仁、水蛭、虻蟲的提取液按全方的比例準確量取，均勻混合，濃縮至3.5 g／mL，于4℃冷藏備用。

2.1.3 抵當湯水提液制備 按照傳統方法將抵當湯四種藥材（劑量如“2.1.2.2”）加1 L純水混合浸泡0.5 h，大火煮開，小火熬至藥液 3／5，去渣，通過旋轉蒸發儀按40∶1比例蒸發濃縮至3.5 g／mL，于4℃冷藏備用。

2.2 小鼠急性毒性實驗

2.2.1 中毒死亡的判定 參見文獻［14］，小鼠灌服小劑量的鉤吻提取液3～4 min后，其主要表現為安靜、發抖、四肢無力及運動失調，呼吸減慢而有間歇，40 min之后基本恢復正常。小鼠灌服大劑量的鉤吻提取液3～4 min后，其表現與上所述情況一致，但時間很短暫，隨即轉向興奮狀態，叩牙頻繁，并伴有痙攣，到后期痙攣強度更大，繼而間歇性驚厥、跳躍，出現全身性劇烈的強直性驚厥，最后呼吸衰竭而死亡［14］。

2.2.2 急性毒性預實驗 取小鼠12只，隨機分成3組，每組 4只，禁食 24 h，自由飲水，分別按 1.5、1.2、1 g／kg的劑量予鉤吻提取液灌胃，觀察并記錄小鼠24 h內的中毒癥狀和死亡情況，確認引起100%（Dm）死亡率的劑量。

2.2.3 急性毒性實驗 將72只小鼠隨機分成9組，鉤吻組（給藥劑量為預試Dm劑量，下同）、抵當湯水提液組、抵當湯醇提液組、先鉤吻后抵當湯水提液組、先抵當湯水提液后鉤吻組、鉤吻與抵當湯水提液混合組、先鉤吻后抵當湯醇提液組、先抵當湯醇提液后鉤吻組、鉤吻與抵當湯醇提液混合組，每組8只，用苦味酸標記，實驗前禁食不禁水24 h，然后各組小鼠按照“2.2.2”中計算所得的劑量進行一次性灌胃給藥，觀察并記錄小鼠24 h內的中毒癥狀和死亡情況。

2.3 鉤吻配伍抵當湯對小鼠血液、肺組織的影響

2.3.1 分組干預 將40只小鼠隨機分成5組，空白組、鉤吻組、抵當湯醇提液組、先鉤吻后抵當湯醇提液組、鉤吻與抵當湯醇提液混合組，每組8只，用苦味酸標記，實驗前禁食不禁水24 h，然后各組小鼠按“2.2.2”方法進行一次性灌胃給藥。小鼠出現中毒癥狀時眼球后靜脈叢取血，未出現中毒癥狀的小鼠給藥后10 min內眼球后靜脈叢取血，并進行肺組織取材。

2.3.2 血清指標檢測 檢測小鼠白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）、乙酰膽堿（ACH）、乙酰膽堿酯酶（CHE）活力變化情況。

2.3.3 肺組織HE染色 取小鼠肺組織，大體觀察后以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。待石蠟凝固后，進行病理組織切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，封片，光鏡下觀察，每張切片200倍鏡下隨機選5個視野進行拍片。

3 結 果

3.1 急性毒性預實驗 急性毒性預實驗結果表明，鉤吻不同劑量給藥后，小鼠出現痙攣、驚厥、跳躍，最后呼吸衰竭而死，死亡時間均在給藥后30 min內。當鉤吻劑量≥1.5 g／kg時，小鼠死亡率均為100%，見表 1，故確定鉤吻的Dm劑量為1.5 g／kg，進行下一步急性毒性實驗。

表1 鉤吻的急性毒性預實驗結果

3.2 各組急性毒性實驗情況比較結果顯示予1.5 g／kg鉤吻后小鼠全部死亡。當配伍抵當湯后，小鼠死亡率均下降，且死亡時間亦明顯延長，與鉤吻組比較有顯著性差異（P＜0.05），見表2。綜合實驗結果，選用鉤吻配抵當湯醇提液進一步考察其減毒作用。

3.3 鉤吻配伍抵當湯對小鼠血清指標的影響 如表3所示，進一步考察藥物對小鼠血液影響，發現鉤吻組小鼠RBC、PLT、HGB、ACH均與空白組呈顯著性差異（P＜0.05），抵當湯鉤吻混合液組小鼠RBC、PLT、HGB、ACH 均與鉤吻組呈顯著性差異（P＜0.05），而與空白組無顯著性差異；而抵當湯與鉤吻給藥前后對白細胞、乙酰膽堿酯酶活力卻并無影響。

3.4 小鼠肺組織形態學變化 空白組小鼠的肺組織可見細支氣管與小靜脈；細支氣管及其分支和肺泡、肺泡壁、肺間質結構正常，未見充血、水腫、纖維素滲出，無炎癥細胞浸潤。鉤吻組肺組織可見細支氣管、肺泡壁、肺間質見大量中性粒細胞浸潤伴充血，肺泡壁毛細血管擴張充血，肺泡腔漿液、紅細胞等滲出，可見局灶性肺組織實變。鉤吻與抵當湯醇提液混合給藥后小鼠肺組織可見細支氣管、肺泡壁、肺間質中性粒細胞浸潤伴充血減輕，肺泡壁毛細血管擴張不明顯，肺泡腔滲出減少，肺組織局灶性實變消失。見圖1。結果表明抵當湯與鉤吻混合后可以降低鉤吻的毒性，改善小鼠肺組織中毒癥狀。

表2 各組急性毒性實驗情況比較

表3 鉤吻配伍抵當湯對小鼠血液、肺組織的影響（x±s）

4 討 論

通過急性毒性實驗結果表明，抵當湯能減緩鉤吻毒性，而傳統水煎和醇提方式抵當湯解鉤吻毒時，發現醇提抵當湯解毒效果高于傳統水煎劑，這是否與傳統水煎方法高溫久煎破壞水蛭與大黃的有效成分有關，有待進一步實驗考察。

血清指標檢測結果表明，小鼠灌服鉤吻后ACH濃度升高，而CHE活力并未受影響。先灌服鉤吻后給抵當湯也造成ACH濃度升高，而直接抵當湯給藥者ACH亦有升高趨勢，說明抵當湯減鉤吻毒性可能不是通過降低ACH而解毒的。在小鼠灌服鉤吻后造成血液中白細胞、血紅蛋白、血小板等出現不同程度降低，并從肉眼觀察亦出現溶血現象。而抵當湯與鉤吻混合給藥后并未造成小鼠白細胞、血紅蛋白、血小板等影響，因此可以推測鉤吻中毒可能是鉤吻生物堿在小鼠胃腸道中迅速進入血管，與小鼠某些功能蛋白結合且破壞血小板，通過血液循環造成呼吸衰竭而致死。先灌服抵當湯再灌鉤吻和灌服鉤吻抵當湯混合液大大減少小鼠的死亡率，說明抵當湯可能提前結合（或絡合）鉤吻生物堿，且被結合（或絡合）的生物堿在抵當湯作用下失去毒性，使其灌胃后具有毒性的生物堿減少；也可能抵當湯與鉤吻一同進入血液循環時，促使鉤吻生物堿不能與小鼠血液中的功能蛋白結合，保護了機體組織，從而起到減毒作用，但具體機制可待進一步研究其血液中蛋白組學。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色圖（×200）

通過考察鉤吻與抵當湯先后順序給藥，抵當湯水提液與醇提液均可降低小鼠死亡率，延長小鼠死亡時間，抵當湯可以減鉤吻毒性，其中先灌服抵擋湯后鉤吻者效果更佳。不同提取方式的抵當湯減鉤吻毒性時，醇提抵當湯比傳統水煎減毒效果更優。