低磷脅迫對不同磷效率基因型煙草苗期生長及生理特征的影響

龔絲雨 梁喜歡 楊帥強 張世川 朱肖文 劉齊元

(江西農業大學農學院/作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室，江西 南昌 330045)

磷(P)是植物生長發育過程中的營養元素之一，也是構成植物體內重要有機化合物(如ATP、磷脂、核酸)的必要元素，在植物能量轉化與物質代謝中發揮著重要的作用[1-2]。磷素是評價土壤肥力的主要指標之一，其含量及有效性對作物的生長發育和新陳代謝具有重要影響[3]。目前，我國耕地土壤有效磷嚴重缺乏，施用磷肥雖能使土壤有效磷含量上升[4]，但存在磷肥利用效率低，生產成本高等問題，且持續施用還會引發水體富營養化等一系列環境污染問題[5-6]。研究發現同一作物的不同品種對低磷脅迫和磷肥效應具有顯著的品種差異[7]。因此，利用磷高效植物種質資源，研究植物對磷素高效吸收利用機理，對降低植物對磷肥的依賴性，建立發展高效、高產、優質、環保的作物生產體系和促進農業可持續健康發展具有重要意義。

煙草(NicotianatabacumL.)是我國栽培的重要經濟作物，每年煙草行業的稅收約占全國總財政收入的10%，具有舉足輕重的地位[8]。研究表明，煙草雖然對磷素需求量不高，但對磷的缺乏極度敏感，生長期間若缺磷則表現出生長緩慢、株體瘦小、葉片窄小、葉色發黑、煙葉化學成分欠協調等癥狀，最終導致煙葉減產和品質下降[9]。

目前，關于不同磷效率基因型作物在低磷脅迫下的生理特性研究已有大量報道，前人通過對大豆[10]、水稻[11]、小麥[12-13]等作物進行研究，發現磷高效品種在低磷條件下的根系活力、可溶性蛋白含量及酸性磷酸酶活性均顯著高于磷低效品種，且其保護酶活性也保持在較高水平，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量明顯更低。高家合等[14]、徐敏等[15]和李華麗[16]對耐低磷及磷高效煙草品種篩選進行了相關研究，而關于不同磷效率類型煙草在磷脅迫下生理特征的研究尚鮮見報道。本試驗在前期研究的基礎上，根據2017年煙草耐低磷及磷高效基因型的篩選結果(尚未發表)，以耐低磷且磷高效品種(K326、云煙105)和低磷敏感且磷低效品種(G28、中煙101)為試驗材料進行磷效率特征探討，以期為進一步研究煙草養分高效生理機理和培育磷高效基因型煙草提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草材料為磷高效且耐低磷品種(K326、云煙105)和磷低效且低磷敏感品種(G28、中煙101)。其中，云煙105由江西省煙葉科學研究所提供，其他3個品種均由國家農作物種質資源平臺煙草種質資源子平臺提供。

1.2 試驗設計

試驗于2018年在江西農業大學實驗基地進行。采用營養液水培方式，選擇飽滿健康的煙草種子進行漂浮育苗，待煙草長至四葉一心期時，挑選長勢一致的煙苗在培養盆(長×寬×高=52 cm×40 cm×15 cm)中等間距定植，進行低磷(LP，0.01 mmol·L-1KH2PO4)與正常磷(NP，1.00 mmol·L-1KH2PO4)營養液處理，營養液體積為8 L·盆-1，各品種每個處理培養1盆，每盆48株。營養液配制方法參照文獻[17]，并用NaOH和H2SO4調節營養液pH值為6.0。NP處理營養液配方：2.5 mmol·L-1NH4NO3、1.0 mmol·L-1KH2PO4、2.4 mmol·L-1K2SO4、4.6×10-2mmol·L-1H3BO3、5.0 mmol·L-1CaCl2、2.0 mmol·L-1MgSO4、9.0×10-3mmol·L-1MnCl2·4H2O、7.65×10-4mmol·L-1ZnSO4·7H2O、3.7×10-2mmol·L-1Fe-EDTA、3.2×10-4mmol·L-1CuSO4、1.6×10-5mmol·L-1(NH4)6MO7O24。LP處理中KH2PO4濃度為0.01 mmol·L-1，其他配方與NP相同，以KCl平衡調整K+。每隔3 d更換1次營養液，每天上午 9：00 用氧氣泵向營養液通氣30 min。從最后一次營養液更換日起連續5 d(6月25日-6月29日)定時(21：00)測定營養液的pH值，處理28 d后開始測定煙草的農藝性狀及相關生理指標。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 農藝性狀的測定 參照煙草標準(YC/T 142-2010)[18]調查煙草株高(cm)、莖粗(mm)等農藝性狀；采用排水法測定根系體積(mL)；像素法測量葉面積(cm2)；利用SPAD-502葉綠素儀(日本美能達公司)測定煙草葉片的葉綠素含量相對值(SPAD值)。將新鮮煙株分為地上部分和根系，105℃殺青30 min，75℃烘干獲得干重。

1.3.2 生理指標的測定 根系活力測定采用氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)還原法；葉片游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮(acidic ninhydrin)法；MDA及可溶性糖含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測定[19]。采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別測定葉片可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活性。其中，ACP以每克組織蛋白在37℃與基質作用30 min產生 1 mg 酚表示其活性，即U·g-1prot；SOD以每克組織在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個酶活力單位，單位為U·g-1FW。采用試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)分別測定葉片過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性。其中，CAT以每克組織每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位，即nmol·min-1·g-1FW；POD以每克組織在每毫升反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位，即U·g-1FW。營養液pH值利用臺式pH測定儀(上海雷磁儀器廠)測定。

1.3.3 耐低磷指數的計算 采用耐低磷指數(low-phosphorus tolerance index，L/N)[20]比較不同磷效率類型煙草在低磷脅迫下的生長及生理特征差異，按照公式計算耐低磷指數：

耐低磷指數=低磷條件下指標測定值/正常磷條件下指標測定值

(1)。

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2007進行數據統計與圖表制作；運用SPSS 22.0進行數據分析，多重比較采用LSD檢驗法，兩組數據間的差異顯著性采用T檢驗法。

2 結果與分析

2.1 不同磷效率煙草農藝性狀的差異

由表1可知，低磷脅迫下，4個煙草基因型苗期農藝性狀均受到不同程度的影響。與正常磷相比，低磷脅迫下煙苗的株高、莖粗、根體積、地上部干重、根干重、最大葉面積及葉片SPAD值均有所減小，而主根長有所增大。對于莖粗而言，G28、中煙101在2種磷素水平下均差異顯著，而K326、云煙105均無顯著差異。除莖粗外，各煙草基因型的其他指標(地上部干重、根干重、株高、SPAD值等)LN與NP間均差異顯著。

表1 不同供磷條件下各煙草基因型苗期農藝性狀特征Table 1 Characteristics of the agronomic trains in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

注：同行不同小寫字母表示下的不同品種間差異顯著(P<0.05)，同列不同大寫字母表示同一品種的不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same line indicate significantly different among different vocrieties under the same treatment at 0.05 level.Different capital letters in the same column indicate significant different among different treatments of the same variety at 0.05 level. The same as following.

低磷脅迫下，不同磷效率煙草品種的各指標變化幅度存在明顯差異，其中株高、SPAD值降幅依次為云煙105(17.50%、28.92%)K326(25.25%)>中煙101(21.90%)>G28(5.14%)。其中，K326和云煙105的主根長增幅較大，地上部與根干重、株高、莖粗等降幅較小，且其L/N值均較大，說明磷高效煙草品種在低磷脅迫下仍能保持較高的磷素利用效率。

2.2 不同磷效率煙草細胞保護酶活性的差異

由表2可知，低磷脅迫顯著提高了各煙草品種的CAT、POD和SOD活性。低磷水平下，G28、中煙101、云煙105和K326的CAT活性較正常磷處理分別提高了23.63%、57.71%、67.23%和88.96%，POD活性分別提高了23.20%、23.23%、40.78%和39.68%，SOD活性分別提高了17.61%、9.63%、38.89%和40.94%。低磷脅迫下，G28的CAT、POD活性增幅均為最低，中煙101的SOD活性增幅最低，K326的CAT和SOD活性增幅最高，云煙105的POD活性增幅最高。結果表明，磷高效品種的細胞保護酶提升幅度較大，而磷低效品種提升較小。CAT、POD和SOD活性的L/N值均表現為K326、云煙105較高，中煙101、G28較低。

2.3 不同磷效率煙草酸性磷酸酶活性的差異

由表3可知，低磷水平下，云煙105、K326根和葉中ACP活性均顯著提高，G28、中煙101根和葉中的ACP活性雖有所增加，但均無顯著差異。根中ACP活性增幅依次為K326(47.94%)>云煙105(25.85%)>中煙101(15.67%)>G28(9.52%)；葉中4個品種的ACP活性變化趨勢同根一致，增幅最大為 K326(49.02%)，其次是云煙105(26.67%)，再次為中煙101(8.79%)，G28(8.77%)最低；根和葉中ACP活性增幅均表現為K326>云煙105>中煙101>G28，說明磷高效品種的ACP活性增幅大于磷低效品種。根中，K326 的L/N值顯著高于其他3個基因型，云煙105 的L/N值顯著高于中煙101、G28；葉中，各煙草基因型的L/N值間無顯著差異。2種處理下，根和葉中的ACP活性均為K326和云煙105較高，說明磷高效品種在LP和NP處理下均具有高效的磷營養效率。同一處理下，各基因型根中ACP活性均高于葉片。

2.4 不同磷效率煙草根系活力及水培營養液pH值的差異

由表4可知，與正常施磷相比，低磷水平下各煙草基因型的根系活力均顯著降低，其中降幅最大的是G28，降低了73.00%，K326降幅最小(25.26%)。根系活力的L/N值以K326為最高，云煙105和中煙101次之，G28最低，表明磷低效煙草品種的根系活性受低磷脅迫的影響更為明顯。

表2 不同供磷條件下各煙草基因型細胞保護酶活性Table 2 Cell protective enzyme activities in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

Note: A:LP. B:NP. C:L/N.圖1 不同供磷條件下各煙草基因型培營養液pH值變化Fig.1 Changes of pH value of nutrient solutions in tobacco varieties under different phosphorus levels

表3 不同供磷條件下各煙草基因型酸性磷酸酶活性Table 3 Acid phosphatase activities in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

由圖1可知，LP和NP處理下，各煙草基因型的營養液pH值隨著處理時間的延長均呈降低趨勢。各煙草基因型的pH值變化存在差異，調整pH值后第1～第5天，LP處理下G28、中煙101、云煙105和K326的pH值由6.00分別下降至3.90、3.81、3.54和3.11，NP處理下pH值由6.00分別下降至4.21、4.18、4.15和3.88，L/N則由1.00分別下降至0.93、0.91、0.85和0.80。LP和NP處理下各品種pH值變化整體均表現為K326>云煙105>中煙101>G28，說明磷高效品種降低根際pH值的能力明顯高于磷低效品種。

表4 不同供磷條件下各煙草基因型根系活力Table 4 Root activities in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

2.5 不同磷效率煙草抗逆生理指標的差異

由表5可知，LP處理下，4個煙草品種的可溶性糖、游離脯氨酸及MDA含量均顯著高于NP，而可溶性蛋白則顯著低于NP。低磷水平下，各煙草基因型可溶性蛋白含量降幅依次為云煙105(35.31%)中煙101(54.32%)>云煙105(22.82%)>K326(22.46%)，游離脯氨酸含量增幅依次為云煙105(65.75%)>K326(64.37%)>中煙101(27.62%)>G28(19.77%)，可溶性糖含量增幅依次為K326(61.42%)>云煙105(46.36%)>G28(31.96%)>中煙101(27.08%)。LP和NP處理下，可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量均以磷高效基因型(K326和云煙105)較大，磷低效基因型(G28和中煙101)較小，上述3個指標的L/N值亦是如此。各基因型煙草MDA含量在NP處理下依次表現為中煙101>云煙105>G28>K326，但無顯著差異，而在LP處理下磷低效基因型品種則顯著高于磷高效基因型品種。

表5 不同供磷條件下各煙草基因型苗期主要生理指標Table 5 Main physiological indexes in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

3 討論

作物在生長前期對磷素缺乏十分敏感，當磷素供給量處于低水平時，植物體內碳水化合物的合成就會受影響，細胞分裂受阻，進而導致植株生長緩慢[16]。本研究中，LP處理下各煙草基因型生長均受到明顯影響，其株高、莖粗、地上部干重、根干重、根體積、最大葉面積及葉片SPAD值均低于NP水平，各煙草基因型的不同指標(除K326、云煙105的莖粗外)在2種磷素水平下的差異均達顯著水平；不同磷效率煙草基因型對磷脅迫的響應不同，磷高效品種(K326和云煙105)的減小幅度明顯低于磷低效品種(G28和中煙101)，表明磷高效品種在磷濃度較低的情況下仍能保持較高的生物量，維持正常生長。Vejchasarn等[21]研究表明，植物在低磷逆境中通過改變根系形態來提高磷素吸收效率。這與本研究結果相同。本研究中，在LP處理下，云煙105、K326、中煙101和G28主根分別增長33.56%、25.25%、21.90%、5.14%，擴大了根系活動范圍，增加了根系與磷素的接觸面積，促進了植物吸收利用更多磷素，保證了植物正常生長[22]。LP條件下，不同基因型煙草的根系指標存在明顯差異，其中K326主根長、根體積及根干重的L/N值分別為1.25、0.79、0.79，云煙105為1.34、0.78、0.73，G28為1.05、0.73、0.35，中煙101為1.22、0.74、0.37。說明磷高效品種根系指標的L/N值較高，受低磷的影響明顯更小，根系適應性優于磷低效品種。這與前人[23-24]的研究結果相同。

低磷不僅使植物的根系形態產生適應性變化，還會引起植物根系甚至全株發生一系列生理變化[25]。植物根系通過分泌有機酸，選擇性吸收陰陽離子等方式酸化根際，以降低根際pH值，活化更多難溶性磷并產生更多有機磷水解酶[26]。本研究中，G28培養液pH值由6.00下降至3.90，中煙101降至3.81，云煙105降至3.54，K326降至3.11，低磷降低了各煙草基因型的培養液pH值，且隨著脅迫時間的延長，pH值降低幅度。此外本研究還發現培養液的pH值降幅因品種而異，磷高效品種的pH值變化幅度更大，更能酸化根際來促進磷素的吸收，適應低磷逆境。這與前人在油菜[27]、小麥[28]等作物上的研究結果類似。說明在一定范圍內，低磷處理時間越長，植物根際pH值越低[28]。根系活力是根系功能的主要衡量指標之一，可在一定程度上反映植物對水分和礦物質的代謝能力。研究發現植物處于逆境中會降低根系活力[29]。這與本研究結果相同。本研究表明，不同磷效率煙草根系活力的降低程度不同，降幅較大的為G28(73.00%)、中煙101(63.77%)，較小的為云煙105(36.74%)、K326(25.26%)，說明磷低效品種的根系生理活性受到的影響更明顯，而磷高效品種在低磷脅迫下表現出較強的新陳代謝能力。

ACP是植物生長過程中一種重要的水解酶，能夠促進有機磷的水解，提高磷素的生物有效性[30]。研究表明，植物在缺磷條件下體內的ACP活性會顯著增強[30-32]。這與本研究結果相同。本研究中，各煙草基因型的ACP活性均呈增加趨勢，說明ACP活性增強是植物對低磷脅迫的適應性反應。張海偉等[33]研究認為，植物磷效率與ACP活性呈正相關，在本試驗中也得到相似結論。LP條件下，根系ACP活性的提高量以K326和云煙105為較大，分別為47.94%、25.85%，中煙101和G28為較小，分別為15.67%、9.52%，葉片也以K326(49.02%)、云煙105(26.67%)為較大，中煙101(8.79%)、G28(8.77%)為較小，具有較高磷效率的煙草基因型不同部位的ACP活性增強效果明顯大于磷低效型，說明磷效率越高，植物體內的ACP活性也越高。但也有學者[34]認為，ACP僅是植物對低磷脅迫的誘導物，而與磷效率無關，具體原因還有待進一步研究。

當植物處于低磷脅迫時體內會產生大量超氧自由基，致使活性氧代謝失衡，從而對植物細胞造成一定的氧化傷害。為了維持正常的生理狀態，植株體內的保護酶(SOD、POD、CAT等)活性會增強，共同作用清除H2O2和自由基[35]。本研究中，低磷脅迫促使各基因型煙草的SOD、POD、CAT活性均顯著增強，這與前人在小麥[35]上的研究結果一致。低磷水平下，不同處理的煙草3種保護酶活性均表現為磷高效品種高于磷低效品種。這與敖雪等[36]發現磷高效基因型大豆CAT、POD及SOD 3種保護酶活性在整個生育期均保持在較高水平的結論相一致。說明磷高效品種的細胞保護能力更強，能通過增強保護酶活性來保證細胞膜的完整性，維持細胞內外的氧化還原平衡，使植物在低磷逆境中能進行正常代謝生長[37]。

植物在逆境條件中會迅速累積大量游離脯氨酸、可溶性糖等滲透調節物質來維持細胞滲透勢，起到保護細胞的作用[38]。本研究中，LP條件下各煙草品種的游離脯氨酸和可溶性糖含量均顯著升高，而可溶性蛋白含量顯著降低，游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量在低磷時表現為磷高效型(K326、云煙105)較高，磷低效型(中煙101、G28)較低。這與李俊等[39]的研究結果一致。本研究還發現在LP水平下，云煙105(22.82%)及K326(22.46%)的MDA含量增幅均顯著低于G28(62.50%)及中煙101(54.32%)，磷高效基因型煙草的MDA含量明顯低于磷低效型，這與前人在水稻[40]、玉米[41]等作物的研究結果相一致。MDA是膜質過氧化的最終產物，其含量能反映膜質過氧化作用水平[42]，磷高效型煙草在LP條件下MDA含量更低，說明膜質過氧化程度更輕，受到的傷害更小，對低磷脅迫的抗性高于磷低效型。

4 結論

與磷低效基因型(G28、中煙101)相比，磷高效基因型(K326、云煙105)在低磷時能夠迅速做出一系列抗逆反應，通過增大主根長和根體積，增強根系活力，提高ACP活性，分泌更多酸性物質，更大程度地增強細胞保護酶系統(CAT、SOD和POD)活性以及積累更多細胞滲透物質，從而減輕低磷脅迫帶來的危害和維持較高磷效率。鑒于時間因素，本試驗未測定煙草的磷素吸收、利用效率以進行ACP活性與磷效率的相關性分析，故后續可將不同基因型煙草的磷效率與ACP活性差異之間的關系作為研究方向。本試驗為苗期試驗，與大田情況可能有所不同，因此仍需大田試驗進行驗證。