鍶對菠菜幼苗生長、光合和抗氧化酶活性的影響

姚 凱 牛曉娟 徐 僡 敖家林

(貴州師范大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

鍶(Sr)元素主要以化合物的形態(tài)出現(xiàn)在自然界，含鍶元素的礦石主要有天青石(SrSO4)和菱鍶礦(SrCO3)。鍶是土壤所含有的堿土元素中豐度最小的化學元素，但隨著核工業(yè)[1]和現(xiàn)代交通[2-3]的快速發(fā)展，其含量在特定區(qū)域的土壤中呈較大幅度增加。光合作用是植物生長和積累的基礎生理過程，外部環(huán)境的變化會對其產(chǎn)生影響。研究表明，重金屬會抑制抗氧化酶活性， 破壞質(zhì)膜系統(tǒng)，抑制光合電子傳遞，影響光系統(tǒng)Ⅱ活性等[4-5]。鈣元素在光合反應過程中具有重要的作用，是光合系統(tǒng)和一些光合酶的結(jié)構(gòu)成分[6]。而鍶和鈣在化學物理性質(zhì)上非常相似，因此在植物細胞內(nèi)的一些代謝過程中鍶能夠替代鈣的功能[7-8]。土壤中的鍶不但會影響農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，還能夠在生物體內(nèi)富集并通過食物鏈累積放大[9]。鍶被人體攝入后，取代鈣集聚在骨骼上，可誘導白血病或其他腫瘤的發(fā)生[10]，過多的鍶攝入會對人類健康產(chǎn)生危害。研究發(fā)現(xiàn)植物可通過根系對鍶進行吸收，且吸收能力與其種屬有關[11-12]。姜曉燕等[10]研究表明，相同條件下，不同種屬植物對鍶富集的能力存在差異，表現(xiàn)為葫蘆科>豆科>禾本科。此外，植物對鍶的吸收還受土壤物理化學性質(zhì)的強烈影響[13-14]。鍶通過根系吸收后隨著木質(zhì)部的蒸騰流而轉(zhuǎn)運，最后固定在植物的韌皮部[15]。研究表明，植物不同器官對鍶的富集能力存在差異，一般表現(xiàn)為根部>葉片>莖部[16-17]。

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)是我國常見的藜科蔬菜之一，以葉片作為主要的食用部位。Soudek等[18]研究發(fā)現(xiàn)植物對鍶的放射性同位素(90Sr)和穩(wěn)定性同位素(88Sr)的吸收無明顯差異。本研究以菠菜幼苗為試驗材料，用不同濃度穩(wěn)定鍶同位素化合物SrCl2對其進行處理，測定其生長參數(shù)、光合指標和抗氧化酶系統(tǒng)的響應情況，以期為闡明鍶環(huán)境對植物的生長生理的影響機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

供試材料：圓葉型菠菜(春新超全)，購自貴陽市種子公司。

選取籽粒飽滿的種子，置于裝有一定體積珍珠巖的育苗盒中，種子上覆蓋珍珠巖的薄層，向育苗盤的盛水盒中注入一定量的蒸餾水，以不浸泡種子為宜，保持培養(yǎng)室溫度25℃、光照14 h，光照強度300 μmol·m-2·s-1PPFD。約7 d后，種子開始萌發(fā)，待幼苗長出4片葉片時，選取生長茁壯的幼苗移植到12孔育苗盒中，每個育苗盒栽培2株幼苗以保持適當間距，保證幼苗在試驗過程中互相不影響光照。移苗后，將種植有植株的育苗盒置于人工氣候室內(nèi)，設置光周期為12 h，光照強度為300 μmol·m-2·s-2PPFD，溫度為25℃，相對濕度為55%～65%。菠菜幼苗采用水培方式培養(yǎng)，以1/2濃度的Hoagland營養(yǎng)液為植物幼苗提供營養(yǎng)和水分。

萌發(fā)后約30 d，植株生長至8葉齡時，去除生長差異較大的植株后，在營養(yǎng)液中分別加入0(CK)、0.1、0.5和2.5 mmol·L-1SrCl2，用0.2 mol·L-1NaOH將處理液pH值調(diào)至7.8。每天在取樣和測試各指標后對處理液進行更換。分別于第5、第10、第15和第20天對植株地上部分鮮重和光合指標進行測量，并采集寬度為30 mm左右的葉片，-80℃保存，用于測量植株葉片在模擬鍶脅迫下的各項生理生化指標。每個處理均設3次生物學重復。

1.2 植株地上部分鮮重測定

本試驗選取植物地上部分鮮重作為衡量植物生長情況的參數(shù)。收獲后立即分離植株地上部分和地下部分，用蒸餾水將植株地上部分洗凈，用吸水紙擦干后立即稱量。

1.3 植株葉片光合指標測定

采用LI-6400XT便攜式光合測量系統(tǒng) (LI-COR公司，美國)測定植株葉片的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、胞間二氧化碳濃度(intercellular CO2concentration，Ci)等光合參數(shù)，每次平行測定同一處理條件下的3株植株，每株測定2片葉片寬度為30～40 mm的葉片，每個葉片重復測定3次。采取人工設定測定條件的方式，設置測定光照強度為300 μmol·m-2·s-1PPFD，溫度25℃，CO2濃度為400 μmol·mol-1。測定時間為14:00-16:00，避開植物可能產(chǎn)生午休現(xiàn)象的時間。

1.4 葉綠素含量測定

參照王學奎等[19]的方法測定菠菜葉片的葉綠素含量。稱取0.1 g葉片加液氮研磨為碎片，加10 mL 80%丙酮混勻，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液1 mL，加入3 mL丙酮，分別于663、645 nm波長下測定OD值，按照公式計算葉綠素a濃度(Ca)和 葉綠素b濃度(Cb)：

Ca= 12.21 A663-2.81A645

(1)

Cb= 20.13 A645-5.03A663

(2)。

1.5 植株葉片相關抗氧化酶活性測定

參照彭方仁等[20]的方法并稍作修改。稱取植物葉片鮮重0.1 g于預冷研缽中，加入1 mL預冷的0.05 mol·L-1pH值 7.8的磷酸緩沖液，在冰浴條件下研磨至勻漿，離心管收集勻漿后用緩沖液定容至2 mL，4℃下 1 000×g離心20 min，取上清液冷藏待測。

1)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定：參照Zhang等[21]的方法并稍做修改。通過測量抑制硝基四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，NBT)的光化學還原能力來測定SOD活性，測定緩沖液含有0.3 mL 20 μmol·L-1核黃素、0.3 mL 150 mmol·L-1L-蛋氨酸、0.3 mL 600 μmol·L-1NBT和0.1 mL酶提取液，最后形成1 mL酶反應體系。采用BlueStar紫外可見分光光度計(LABTECH公司，美國)測定560 nm波長下吸光度值。整個酶反應在強度為170 μmol·m-2·s-1PPFD的光照下持續(xù)反應20 min。以抑制 50%NBT發(fā)生光化學還原為 1個酶活性單位。

2)過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測定：參照郝建軍等[22]的方法并稍做修改。將0.2 mL酶提取液和40 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚、3% H2O2、100 mmol·L-1pH 值6.5磷酸鉀緩沖液形成2 mL酶反應體系，采用紫外可見分光光度計測定470 nm波長下吸光度。

3)過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定：參照郝建軍等[22]的方法并稍作修改。將0.1 mL酶提取液和50 mmol·L-1磷酸緩沖液、3%H2O2形成1 mL酶反應體系，采用紫外可見分光光度計于240 nm波長下測定吸光度值，連續(xù)測定5 min。

1.6 丙二醛含量測定

參照Zheng等[23]的方法測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量：稱取植物葉片0.1 g，加入2 mL 0.1%(w/v)三氯乙酸研磨為勻漿，4℃下 5 000×g離心10 min。取上清液1 mL，加入1 mL 0.5%(w/v)硫代巴比妥酸制成混合液，100℃反應20 min，然后在冰浴中迅速冷卻，8 000×g離心10 min，取上清液分別于450、532和600 nm波長下測定吸光度值。按照公式計算MDA含量(μmol·L-1)：

MDA含量=6.45(OD532-OD600)-0.56 OD450

(3)。

1.7 葉片鍶濃度測定

稱取采集的植物樣本5 g，60℃充分烘干。烘干后研磨成細末，過100目篩。采用濕法消解法 [HNO3+HClO4(3∶1，v/v)]消解，然后采用AA320火焰原子吸收分光光度計(上海儀電科學儀器股份有限公司)測量樣品中Sr含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。采用SPSS 22.0 進行ANOVA分析，組間差異進行顯著性t檢驗，以P<0.05作為顯著性依據(jù)；Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sr2+對菠菜幼苗生長的影響

由表1可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，隨著處理時間的延長，菠菜地上部分生物量與CK均無顯著差異。0.5 mmol·L-1SrCl2處理對植株的生長先表現(xiàn)出促進作用，在處理第10天較CK顯著上升16%；隨著處理時間的延長，菠菜幼苗生長受到一定的抑制，在第20天較CK顯著下降10%。2.5 mmol·L-1SrCl2處理對菠菜幼苗生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，第5天較CK下降12%，且隨著處理時間的延長，抑制效果越明顯，第20天時較CK顯著下降48%。

表1 不同Sr2+處理濃度下菠菜幼苗(單株)地上部分生物量Table 1 The aboveground part biomasses of Spinacia oleracea L. seedlings (individual plant) under different Sr2+ treatments /(g FW)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same colum indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.

2.2 Sr2+對菠菜幼苗光合指標的影響

由圖1-A可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理的Pn與CK相比，未表現(xiàn)出顯著的差異。隨著處理時間的延長，0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，Pn呈先升高后降低的趨勢，處理第5天達到最高，較CK上升5%，隨后逐漸下降，處理第20 天時較CK降低15%。2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，菠菜幼苗的Pn急劇下降，處理第15天趨于穩(wěn)定，較CK下降35%。Ci與Pn為相對應關系，Pn高時，胞間CO2被快速消耗；Pn低時，CO2在細胞間積累。由圖1-B可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，Ci迅速下降，在處理第5～第10天略有上升，處理第10天后Ci隨著處理時間的延長逐漸降低，在處理第20天達到最低，較CK下降21%；0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，Ci呈先下降后升高的趨勢，在處理第5天最低，為CK的87%，在處理第20天最高，較CK上升13%。2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，菠菜幼苗的Ci隨著處理時間的延長持續(xù)上升，處理第20天較CK上升38%。結(jié)果表明，低濃度的Sr2+對菠菜光合能力有一定促進作用，而高濃度的Sr2+會抑制植株的光合作用。

圖1 Sr2+處理對菠菜幼苗的光合參數(shù)的影響Fig.1 Effect of Sr2+ treatments on photosynthetic parameters of Spinacia oleracea L. seedlings

2.3 Sr2+對菠菜幼苗葉綠素含量的影響

由圖2可知，SrCl2處理下，菠菜葉片中葉綠素a和葉綠素b整體變化趨勢有一定差異。但隨著處理時間的延長，葉綠素a和葉綠素b含量與CK相比均明顯下降且Sr2+處理濃度越高下降幅度越大。在處理第20天，0.1、0.5和2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，葉綠素a含量CK分別下降5%、9%和22%，葉綠素b含量較CK分別下降6%、21%和40%。結(jié)果表明，Sr2+處理對菠菜葉片中葉綠素a和葉綠素b含量均有抑制作用，且對葉綠素b的抑制效果要高于葉綠素a。

圖2 Sr2+處理對菠菜幼苗的葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of Sr2+ treatments on chlorophyll contents of Spinacia oleracea L. seedlings

2.4 Sr2+對菠菜幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3-A可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理的SOD活性與CK相比無明顯差異；0.5 mmol·L-1SrCl2處理的SOD活性從處理第5天開始逐漸上升，在處理第20天達到最高，較對照增加56%；2.5 mmol·L-1SrCl2處理的SOD活性呈先上升后下降的趨勢，在處理第15天達到最高，較CK增加102%，隨后急劇下降。由圖3-B可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，POD活性與CK相比無明顯差異；0.5 mmol·L-1SrCl2處理的POD活性呈先下降后上升的趨勢，在處理第20天達到最高，較CK增加37%；2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，POD活性呈先上升后下降的趨勢，在處理第15天達到最高，較CK增加128%，隨后急劇下降。由圖3-C可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，CAT活性與CK相比無明顯差異； 0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，CAT活性在處理第5天后逐漸上升，在處理第20天達到最高；2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，CAT活性呈先上升后下降的趨勢，在第15天達到最高，較CK增加54%，隨后急劇下降。結(jié)果表明，環(huán)境中Sr2+濃度的升高增強了對植物的氧化脅迫。SOD、POD和CAT活性對Sr2+脅迫表現(xiàn)出較為一致的變化規(guī)律。

圖3 Sr2+處理對菠菜幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of Sr2+ treatments on antioxidative enzyme activities of Spinacia oleracea L. seedlings

2.5 Sr2+對菠菜幼苗MDA含量的影響

MDA是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量能夠反映植物細胞在脅迫下受到傷害的程度。由圖4可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，菠菜葉片中的MDA含量較CK無明顯變化；0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，MDA含量在處理第5天后開始升高，在處理第20天達到最高；2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，MDA含量快速上升，處理第20天的MDA含量較CK增加68%。結(jié)果表明，環(huán)境中Sr2+濃度越高，處理時間越長，植物細胞膜受到的氧化傷害越強。

圖4 Sr2+處理對菠菜幼苗的MDA含量的影響Fig.4 Effect on Sr2+ treatments of of Spinacia oleracea L. seedlings

2.6 不同濃度Sr2+處理下菠菜葉片中Sr2+的積累濃度

環(huán)境中的鍶能夠被植物通過根系吸收并在體內(nèi)積累。由圖5可知，0.1 mmol·L-1SrCl2處理下，菠菜葉片中的Sr2+積累濃度未隨著時間的延長發(fā)生明顯變化，基本保持在35 mg·kg-1左右；0.5 mmol·L-1SrCl2處理下，Sr2+積累濃度隨著處理時間的延長逐漸上升，在處理第20天達到最高，為318.33 mg·kg-1；2.5 mmol·L-1SrCl2處理下，植物葉片中Sr2+積累濃度隨著處理時間的延長不斷上升，在處理第20天達到最高，為857.51 mg·kg-1。

圖5 菠菜葉片中Sr2+的積累濃度Fig.5 Sr2+ concentrations in Spinacia oleracea L. leaves

3 討論

研究表明，葉片是吸收與富集Sr2+的主要器官[24, 16]，也是植物進行光合生長的重要器官。本研究中，0.5 mmol·L-1SrCl2處理初期，菠菜葉片的Pn有所上升。這與前人研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的Sr2+處理能夠增強植物光合能力的結(jié)論一致[25]。本研究中，Sr2+處理對菠菜葉片中葉綠素a和葉綠素b含量均有抑制作用，其中葉綠素b對Sr2+處理更為敏感，這與前人研究結(jié)果相同[26-27]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)植物光合能力的變化與葉綠素a和葉綠素b含量的變化趨勢并不完全一致，表明Sr2+處理可能對光合作用的其他過程產(chǎn)生了影響，具體情況還有待進一步研究。

環(huán)境脅迫可破壞植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的平衡機制，從而使活性氧簇(eactive oxygen species, ROS)過量積累，導致植物體發(fā)生一系列氧化脅迫現(xiàn)象。植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)對清除ROS具有重要的作用，SOD、POD和CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性能夠影響逆境下葉綠素、蛋白質(zhì)的降解速度及葉片功能，與植物的抗逆性密切相關。本研究中，Sr2+處理下的SOD、POD和CAT活性的變化規(guī)律較為一致，均隨著Sr2+處理濃度的增加明顯上升，表明Sr2+處理對植物產(chǎn)生了氧化脅迫的作用；且在2.5 mmol·L-1SrCl2處理后期，SOD、POD和CAT活性均出現(xiàn)大幅度下降，這可能是在長時間高濃度的Sr2+處理下，氧化脅迫導致植物整體的生理功能下降所致。ROS對不飽和脂肪酸氧化或過氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化物進一步降解成MDA[28]。MDA是植物細胞膜脂過氧化傷害的主要產(chǎn)物之一，具有較強的細胞毒性，其含量能夠反映膜脂過氧化水平和膜結(jié)構(gòu)的傷害程度[29]。本研究中，高濃度長時間的Sr2+處理使細胞內(nèi)MDA含量明顯上升，這可能是由于植物根系不斷吸收Sr2+，導致Sr2+在植物體內(nèi)富集量增加，從而對植物的傷害作用也隨之增強。

本研究還發(fā)現(xiàn)隨著Sr2+處理濃度的增加和處理時間的延長，其對植物生長的抑制作用不斷增強，但0.1 mmol·L-1SrCl2處理對植物生長及生理指標均未產(chǎn)生明顯影響，這可能與Sr2+處理的濃度較低及試驗材料處于快速生長期有關。生物量的快速增加稀釋了Sr2+在植物葉片內(nèi)的濃度，使其對植物產(chǎn)生的生理影響降低；而在較高濃度的鍶處理下，Sr2+在植物葉片中快速積累，并對植物的生長生理產(chǎn)生了較大影響。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，低濃度的Sr2+處理對菠菜的光合能力表現(xiàn)出一定的促進作用，但是隨著Sr2+處理濃度的增強和處理時間的延長，Sr2+對菠菜的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，這種抑制作用也同時體現(xiàn)在菠菜的光合能力和氧化脅迫響應上。同時，Sr2+處理濃度越高、處理時間越長、Sr2+在菠菜葉片內(nèi)的富集量越多，對植物生長的抑制作用也越強，但植物葉片內(nèi)低濃度的Sr2+富集對菠菜生長的影響并不明顯。