循環miRNAs評估頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的臨床意義

程興 潘小玲 楊雯 胡傳琛 陸海鵬 王建偉 應鳴翹 傅亞明 邵慧軍 陳紅芳

缺血性腦卒中易導致患者殘疾甚至死亡，其中由于頸動脈粥樣硬化斑塊破裂、脫落所致的缺血性腦卒中約占20%。然而，目前臨床上缺乏可以有效評估斑塊穩定性以便篩選缺血性腦卒中高危人群的生物標志物。miRNAs是真核生物體內能夠可逆性調控基因表達的一類非編碼RNA，參與幾乎所有人體生命活動的主要進程，包括細胞增殖、分化和凋亡等[1]。本研究選取5種可能與動脈粥樣硬化斑塊形成相關的miRNAs，即miR-21、miR-126、miR-155、miR-221、miR-222，比較其在不同類型頸動脈粥樣硬化斑塊患者中的表達水平，并探討這些指標評估斑塊穩定性的臨床意義，現將研究結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年9月至2017年3月我院神經內科就診的腦梗死組患者35例（腦梗死組），其中男24 例，女 11 例，年齡 50～84（69.3±10.6）歲；同期體檢中心經多普勒彩超證實存在頸動脈不穩定斑塊患者41例（不穩定斑塊組），男 24例，女17例，年齡 45～90（66.0±11.2）歲；穩定斑塊患者 28例（穩定斑塊組），男16 例，女 12 例，年齡 58～82（68.3±5.8）歲；另選健康體檢者30例作為健康對照組，其中男16例，女14例，年齡54～78（66.7±7.2）歲。腦梗死組患者診斷均符合2014年中國急性缺血性腦卒中診治指南標準，經頭顱MRI檢查證實為頸內動脈系統的腦梗死，且經多普勒彩超證實合并存在頸動脈不穩定斑塊。所有受試者均排除急慢性炎癥、惡性腫瘤及血液系統疾病，并均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料比較 記錄并比較4組對象吸煙、飲酒情況及高血壓、糖尿病、冠心病、房顫患病率，記錄并比較各組血脂 4項水平（LDL－C、HDL－C、TG、TC）。

1.2.2 實時定量熒光PCR（RT－qPCR）檢測 引物設計及合成委托上海吉瑪制藥技術有限公司進行，各基因的引物序列見表1。以Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、氯仿提取血漿總RNA，異丙醇沉淀回收RNA，75%乙醇洗滌RNA沉淀，焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶解，得到RNA溶液。利用提取的總RNA，加入特異性引物，用DEPC 水定容至 12μl，70℃溫浴 5min，迅速置冰上 10s。離心，加入 4μl反應緩沖液、2μl dNTP、1μl RNA 酶抑制劑、1μl RevertAidTMM－MuLV 逆轉錄酶（加拿大 Fermentas公司），37℃溫浴 5min，42℃溫浴 1h，70℃溫浴10min后終止反應。Q－PCR利用SYBR GreenⅠ PCR試劑盒（上海吉瑪制藥技術有限公司）完成。PCR反應條件：95℃ 10min；然后進入 95℃ 15s，60℃ 1min的循環（共40次），每個反應有3次重復。以5S rRNA作為內參基因，采用2－ΔΔCt方法計算相對表達量，各組相比健康對照組的表達倍數差異采用log2轉換。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；健康對照組與腦梗死組中miRNAs和血脂水平的相關性采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 RT-qPCR反應引物序列

2 結果

2.1 4組對象的一般資料比較 見表2。

表2 4組對象的一般資料比較

由表2可見，4組對象吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、冠心病、房顫患病率差異均無統計學意義（均P＞0.05）。腦梗死組、不穩定斑塊組的TC水平明顯高于健康對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。腦梗死組的HDL-C水平明顯低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 4 組對象的 miR-21、miR-126、miR-155、miR-221、miR-222表達水平比較 見表3。

表 3 4 組對象的 miR-21、miR-126、miR-155、miR-221、miR-222 表達水平比較

由表3可見，腦梗死組、不穩定斑塊組、穩定斑塊組的 miR-21、miR-155、miR-221、miR-222 表達水平均明顯高于健康對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。不穩定斑塊組的miR-126表達水平低于穩定斑塊組，腦梗死組的miR-126表達水平低于不穩定斑塊組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

2.3 miRNAs表達水平與血脂4項水平的相關性 見表4。

表4 miRNAs表達水平與血脂4項水平的相關性

由表4可見，腦梗死組的miR-126表達水平與LDL-C、TC 水平呈負相關，而 miR-21、miR-155、miR-221、miR-222與血脂水平無明顯相關性。

3 討論

動脈粥樣硬化是累及中等或大血管的慢性血管炎癥性疾病，目前認為其病理機制涉及血管內皮功能的失調引起管壁粥樣硬化斑塊的沉積，進一步發展導致血管的缺血、閉塞。miRNAs可通過調控血管內皮細胞的功能，參與血管平滑肌細胞從非增殖狀態到增殖狀態的轉化，與動脈粥樣硬化形成密切相關。本研究選取迄今為止文獻報道在人體或動物實驗中發現可能與動脈粥樣硬化相關的其中5種miRNAs，即miR-21、miR-126、miR-155、miR-221、miR-222，進一步探究其在不同類型頸動脈粥樣硬化斑塊的表達差異。

通過比較5種miRNAs在腦梗死組、不穩定斑塊組、穩定斑塊組及健康對照組血漿中的表達水平，我們發現的確存在miRNAs表達水平的明顯變化。其中，miR-21、miR-155、miR-221、miR-222 在腦梗死組、不穩定斑塊組、穩定斑塊組患者中均明顯升高，提示其可能起到促進動脈粥樣硬化形成的作用。有研究表明，動脈血管中miR-21的異常過表達易導致新生血管內膜損傷從而增加心血管事件風險[2-3]。Raitoharju等[4]發現miR-21在頸動脈粥樣硬化患者中的表達水平顯著上升，與我們的研究結果相一致。miR-155與內皮細胞炎癥應答及機體免疫系統功能密切相關，通過調控內皮細胞一氧化氮合酶而影響血管內皮的舒張，從而促進動脈粥樣硬化的發生[5]。在動脈粥樣硬化小鼠的外周血和巨噬細胞中，miR-155的表達水平明顯升高，敲除或抑制miR-155可明顯縮小斑塊的大小及抑制巨噬細胞的積聚[6-7]。而miR-221、miR-222的生物學功能則被認為具有細胞特異性：在血管平滑肌細胞中，miR-221、miR-222具有促進細胞增殖、遷移、凋亡的作用，而在血管內皮細胞中其作用則恰好相反[8]。本研究值得關注的另一個發現，miR-126在腦梗死組、不穩定斑塊組、穩定斑塊組之間存在顯著梯度性的下降。miR-126在血管內皮細胞中高度表達，與血管重塑密切相關，可調控血管細胞黏附分子1、單核細胞趨化蛋白等相關靶基因的表達[9]。目前研究認為，miR-126的表達升高可起到抗動脈粥樣硬化作用。在大鼠線栓法大腦中動脈閉塞模型中，血清miR-126的表達水平被檢測到明顯的降低[10]。目前認為，斑塊的穩定性主要與其內部脂質含量相關，其中主要指的是氧化LDL-C[11]。另外，我們在腦梗死組與健康對照組比較中發現，miR-126的表達水平與LDL-C、TC水平呈明顯負相關。因而，本研究首次揭示miR-126可能與頸動脈粥樣硬化斑塊的發展、演變密切相關，并且有望成為預測腦卒中風險評估的生物標志物。

本研究測定了與動脈粥樣硬化斑塊形成、演變密切相關的5種miRNAs在不同類型頸動脈粥樣硬化斑塊，即腦梗死組、不穩定斑塊組、穩定斑塊組及健康對照血漿中的表達水平。我們發現miR-21、miR-155、miR-221、miR-222在腦梗死組、不穩定斑塊組、穩定斑塊組中均明顯升高，提示可能起著促進動脈粥樣硬化形成的作用。而miR-126在腦梗死組、不穩定斑塊組、穩定斑塊組之間存在顯著梯度性的下降，揭示miR-126可能與頸動脈粥樣硬化斑塊的發展、演變落密切相關，并且有望成為預測腦卒中風險評估的生物標志物，值得后續更大樣本或多中心的病例對照研究進行進一步的論證。