siRNA沉默CD44表達對人膽囊癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

蔡煒龍 余勝 汪偉民 許洪寶 樓能

膽囊癌是膽道系統最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，5年生存率低于5%[1]。由于膽囊癌早期癥狀并不顯著，易被忽略，且膽囊癌的進展較快，易發生遠處轉移，發現時多處于晚期，失去治療的機會[2-3]。CD44是一種透明質酸受體，參與細胞黏附、淋巴細胞遷移、歸巢等過程[4]。近年來越來越多的研究開始關注CD44的功能，研究發現CD44在前列腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中異常高表達，并且CD44的異常表達與惡性腫瘤的預后相關[5-8]。而CD44在膽囊癌中的表達及其作用研究報道較少。本研究擬通過觀察CD44對人膽囊癌細胞株EH-GB1和GBC-SD增殖、侵襲和遷移的影響，探討CD44對膽囊癌細胞的作用，為防治膽囊癌尋找可能有效的治療靶標。

1 材料和方法

1.1 細胞培養 人膽囊癌細胞株EH-GB1和GBC-SD由中國科學院上海生命研究院細胞資源中心提供。用10%DMEM培養基并加入1%的鏈霉素和青霉素，置于5%CO2培養箱、37°C 培養。

1.2 試劑與耗材 CD44抗體、兔二抗購自美國CST公司，培養基購自美國Gibico公司，CCK8試劑盒、結晶紫、BCA試劑盒等購自上海碧云天生物科技有限公司,siCD44購自上海拓然生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組和轉染siRNA 分別將EH-GB1和GBCSD細胞分為陰性對照組（si-NC組）和siRNA干擾技術沉默CD44實驗組（si-CD44組），si-NC組轉染si-NC，si-CD44組轉染si-CD44。分別將GBC-SD和EH-GB1鋪于6孔板內，24h后，根據說明書，用Lipofectamine 2000轉染膽囊癌細胞，每6孔板內轉染50nmol siRNA，轉染6h后，更換培養基繼續培養。待48h后收集膽囊癌細胞進行后續實驗。

1.3.2 CCK8細胞生長實驗 將轉染后的細胞常規消化、離心、重懸后計數，將細胞接種于96孔板內，每孔細胞數1 000個，每組處理細胞設置4個復孔，放于細胞培養箱內孵育。分別于6h、第1、2、3、4、5天加入10%CCK8，37°C避光孵育2h后，用酶標儀檢測450nm時的吸光度（OD）值。以上實驗重復3次。

1.3.3 Transwell侵襲、遷移實驗 Transwell小室實驗分為遷移小室實驗和侵襲小室實驗，前者無基質膠而后者有基質膠。實驗前將Transwell侵襲小室置于24孔培養基內水化。將轉染后的細胞常規消化、離心，用無血清DMEM培養基重懸后計數。在Transwell小室上室內加入 200μl（2萬個細胞）培養基，下室加入 500μl 10%DMEM，孵育24h。取出Transwell小室，吸走小室內培養基，向下室加入多聚甲醛，室溫固定20min，然后加入0.1%結晶紫染色，室溫染色20min，擦掉未遷移的細胞后晾干，顯微鏡下計數5個不同視野的細胞數。

1.3.4 Western blot實驗 膽囊癌細胞經過轉染si-CD44 48h后，棄上清液，用PBS清洗2次，加入RIPA細胞裂解液裂解20min，進行離心。利用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。樣品加入6×蛋白上樣緩沖液煮沸變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳進行電泳，隨后進行轉膜。轉膜結束后，用5%脫脂奶費常溫封閉1h，隨后在一抗4℃孵育過夜，第2天用TBST進行洗膜，孵育二抗1h。結束后，用電化學發光儀進行顯影、曝光。

1.4 統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件，所有實驗數據均為3次重復實驗的平均值，計量資料以表示，兩組比較用采用Student’t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染si-CD44后兩組細胞內CD44的表達情況見圖1。

圖1 轉染si-CD44后兩組細胞CD44表達情況比較（a：蛋白表達電泳圖；b：RT-PCR結果比較，與si-NC組比較，**P＜0.01）

由圖1可見，與si-NC組相比，si-CD44組的條帶明顯變細，表明其CD44蛋白表達量明顯降低，siRNA基因沉默效果好（圖1a）；通過RT-PCR再次驗證，si-CD44組中CD44表達量明顯低于si-NC組，差異有統計學意義（P＜0.01），進一步表明si-CD44組基因沉默效果好（圖1b）。

2.2 轉染si-CD44后兩組細胞增殖情況 見表1、2及圖2。

由表1、2及圖2可見，EH-GB1和GBC-SD細胞轉染si-CD44后，CCK8增殖實驗表明，與si-NC組相比，si-CD44組的增殖無明顯變化，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.3 轉染si-CD44后兩組細胞遷移情況 見圖3。

由圖3可見，Transwell小室細胞遷移實驗顯示，在人膽囊癌細胞系EH-GB1中，si-NC組的穿膜細胞數為（193.7±3.9）個，明顯大于 si-CD44 組的（88.7±5.8）個（t=15.12，P＜0.05）；在人膽囊癌細胞系 GBC-SD 中，si-NC組的穿膜細胞數為（193.7±7.8）個，明顯大于si-CD44組的（110.3±5.5）個（t=10.42，P＜0.05）；si-CD44 組與si-NC組相比，遷移細胞數目明顯減少。

2.4 轉染si-CD44后兩組細胞侵襲情況 見圖4。

由圖4可見，Transwell小室細胞侵襲實驗顯示，在人膽囊癌細胞系EH-GB1中，si-NC組的穿膜細胞數為（175.3±7.5）個，明顯大于 si-CD44組的（85.3±3.7）個（t=10.74，P＜0.05）；在人膽囊癌細胞系 GBC-SD 中，si-NC組的穿膜細胞數為（188.0±9.0）個，明顯大于si-CD44 組的（73.0±3.6）個（t=11.84，P＜0.05）；si-CD44 組與si-NC組相比，侵襲細胞數目明顯減少。

表1 EH-GB1轉染si-CD44后兩組細胞OD值比較

表2 GBC-SD轉染si-CD44后兩組細胞OD值比較

圖2 CCK8增殖實驗的細胞生長曲線

圖3 轉染si-CD44后EH-GB1和GBC-SD細胞遷移情況（a:兩組細胞結晶紫染色示意圖，×200；b：兩組穿膜細胞數比較，與si-NC組比較，*P＜0.05）

3 討論

膽囊癌作為膽道系統最常見的惡性腫瘤，惡性程度較高，易侵犯周圍臟器及向淋巴結等器官轉移,尋找有效的標志物在膽囊癌疾病診斷和治療中具有重要意義。CD44是一種膜整合蛋白，是跨膜透明質酸的主要受體，是一種多功能的蛋白，介導細胞與細胞間、細胞與基質間的接觸和結合，參與了很多重要的生物學過程[7]，其陽性表達對多種惡性腫瘤的不良結局起重要作用。Hsu等[8]發現CD44在胰腺癌組織中高表達，并與胰腺癌的不良預后相關，Wood等[9]報道CD44與胰腺癌的侵襲和轉移相關。Gao等[10]利用慢病毒介導的siRNA敲低肝細胞系中CD44表達后發現上皮間質轉化表型被逆轉，從而使癌細胞在體外遷移及侵襲能力減弱，Yang等[11]發現伴CD44高表達的肝細胞肝癌中血管內皮生長因子（VEGF）也同時升高，并且組織中微血管密度（MVD）明顯上升，與腫瘤血管生成、復發及轉移有關。此外，CD44能夠促進結腸癌和乳腺癌的侵襲、遷移，可能是腫瘤細胞內CD44的異常高表達通過增加其與細胞外基質配體透明質酸的親和力，增強了腫瘤的侵襲性[12-13]。還有研究表明，siRNA介導的CD44下調可顯著減弱骨肉瘤細胞的遷移、侵襲和生存能力,這可能是通過CD44與透明質酸的相互作用增加嚴重聯合免疫缺陷（SCID）小鼠骨肉瘤肺轉移的形成[14]。另有研究認為，CD44可以作為臨床早期診斷結直腸癌肝轉移的生物學指標[15]。CD44通過與透明質酸結合，對細胞存活、抗凋亡蛋白的活化有一定的影響，從而導致肝癌和肺癌的腫瘤細胞增殖和腫瘤發生[16-17]。此外，CD44的表達也被認為是預測骨肉瘤、卵巢癌和胃癌化療敏感性的重要生物標志物[14，18-19]。這些結果均表明CD44作為惡性腫瘤生物靶標的可能性。

圖4 轉染si-CD44后EH-GB1和GBC-SD細胞侵襲情況（a:兩組細胞結晶紫染色示意圖，×200；b：兩組穿膜細胞數比較，與si-NC組比較，*P＜0.05）

人膽囊癌細胞系GBC-SD來源于低分化膽囊癌患者原位瘤組織，能反映原腫瘤細胞特性，而EH-GB1取材于膽囊癌患者的腹壁轉移灶，能反映出膽囊癌的高轉移活性，因此，同時以它們作為載體，可以較準確的反映膽囊癌的生物學特性。本研究中筆者運用RNA干擾技術在膽囊癌細胞中敲低CD44的表達，Western blot及RT-PCR均顯示，EH-GB1和GBC-SD細胞中CD44蛋白表達量均明顯降低。通過CCK8增殖實驗發現，敲低CD44后對體外膽囊癌細胞EH-GB1和GBC-SD的增殖能力均無明顯影響；而遷移和侵襲實驗顯示，si-NC組24h的穿膜細胞數明顯少于si-CD44組，提示沉默CD44基因后，人膽囊癌細胞株EH-GB1和GBC-SD遷移和侵襲能力均明顯受到抑制，表明CD44可能通過影響膽囊癌細胞的侵襲遷移能力從而促進膽囊癌的發生、發展，這可能由于CD44作為多功能細胞表面黏附分子，通過對膽囊癌細胞及細胞外基質的結合產生影響，而促進腫瘤細胞的侵襲、轉移，但其具體機制仍待進一步研究。我們的實驗結果與以往研究結果一致[20]。這些結果表明CD44可能作為膽囊癌治療的新靶點，通過抑制CD44的表達，可能有效防止膽囊癌的侵襲及轉移，為膽囊癌的治療提供了新的思路。

綜上所述，CD44在膽囊癌中表達與人膽囊癌細胞EH-GB1和GBC-SD的侵襲及遷移密切相關，沉默EH-GB1和GBC-SD中CD44的表達，可顯著抑制其侵襲、轉移活性，這可能會為膽囊癌的治療提供新的分子靶點，但是CD44調控膽囊癌的侵襲遷移能力的具體機制仍待進一步探索。