miR-143在卵泡刺激素介導的卵巢顆粒細胞孕酮生成中的作用

高小博，姚楠，2，鄭盼盼，2，駱海燕，馬旭，陸彩玲，2*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所遺傳優生中心，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100005)

顆粒細胞是卵泡的重要組成部分，圍繞在卵母細胞周圍為其提供營養并參與卵泡的發育。顆粒細胞也是女性性激素(主要包括甾體激素雌激素和孕酮)的主要來源，這些性激素調控了正常的月經周期和生殖，因此顆粒細胞的增殖和分化是女性擁有正常生育功能的必要因素[1]。在卵泡刺激素(FSH)的刺激下，顆粒細胞增殖、分化以及具有了合成甾體激素的能力[2]。

miRNAs是一類長約22nt的非編碼的單鏈RNA分子，廣泛存在于線蟲、植物、動物及人類的細胞中。miRNA作為基因轉錄后水平的調控因子，主要以堿基配對的方式結合到靶mRNA的3’非翻譯區(3’UTR)，通過抑制或促進翻譯或降解mRNA的方式進行轉錄后調控[3-4]。miR-143是一個高度保守的miRNA，在血管損傷和重構[5]、血液腫瘤發生和發展[6]、脂肪分泌及能量代謝[7]和調控神經功能[8]等方面扮演重要角色。近年來，隨著對miRNA的深入研究，發現miRNA在顆粒細胞增殖和甾體激素分泌中具有廣泛的調節作用。本課題組前期研究發現，miR-143主要分布于小鼠卵巢的卵泡顆粒細胞中，隨著卵泡的發育miR-143在初級和次級卵泡中的表達水平較高[9]。Zhang等[10]證明在FSH介導的小鼠顆粒細胞中，miR-143沉默顯著促進顆粒細胞的增殖，并且miR-143抑制劑在翻譯和翻譯后水平上調3β-羥基固醇脫氫酶(3β-HSD)、芳香化酶(CYP19A1)、17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSD1)等甾體激素合成相關基因的表達。然而，miR-143對FSH顆粒細胞孕酮生成的影響未見報道，本文進行了miR-143對FSH誘導顆粒細胞產生孕酮的作用研究。

材料和方法

一、實驗材料

反轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)，RNA提取試劑Trizol(美國Thermo Fisher Scientific公司)，DMEM/F12液體培養基、胎牛血清(美國Hyclone公司)，對照重組腺病毒Ad-miRNC和過表達miR-143的重組腺病毒Ad-miR143均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，miR-143 TaqMan MicroRNA Assays(美國Thermo Fisher Scientific公司)，碘[125I]孕酮放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術研究所有限公司)。CO2恒溫細胞培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)，ABI Prism 7500實時定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，TC-512梯度PCR儀(英國Techne公司)，xh6080放免儀(西安核儀廠)。

二、研究方法

1.原代顆粒細胞培養：21日齡的雌性SD大鼠購自于維通利華公司，本研究所有實驗均按照《實驗動物護理與使用指南》的要求進行。每只SD大鼠腹腔注射20 U的孕馬血清(PMSG)飼養48 h后，頸椎脫臼處死并在無菌條件下取出雙側卵巢，剔除卵巢被膜及周圍組織，用1 ml注射器針頭刺破卵泡使顆粒細胞釋放出來，將顆粒細胞重懸于含15%FBS的DMEM/F12培養基中，并以合適的密度接種于細胞培養皿中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，以備后續處理。

2.顆粒細胞RNA提?。喝?5 mm培養皿中經過不同處理的原代顆粒細胞，棄培養液后加入PBS洗2次，吸去PBS后加入RNA提取試劑Trizol，充分吹打至細胞完全裂解后，利用苯酚/氯仿抽提、異丙醇沉淀的方法提取RNA。

3.顆粒細胞miRNA實時定量RT-PCR檢測：miR-143實時定量RT-PCR檢測根據Applied Biosystems公司的TaqMan MicroRNA Assays試劑盒進行檢測，首先采用莖環結構的特異性引物進行逆轉錄，然后再采用miR-143特異性的TaqMan探針進行檢測。

4.病毒感染及FSH處理：原代顆粒細胞在含有15%FBS的DMEM/F12培養基中培養過夜，12 h后，DMEM/F12清洗細胞2～3次，洗去未貼壁的細胞，每個35 mm培養皿中加入1.5 ml含有10%FBS、無抗生素的DMEM/F12培養基，以3×1011粒子/ml的腺病毒感染顆粒細胞，于CO2培養箱內培養5 h，隨后將培養基換為無血清、無抗生素的DMEM/F12培養基，于CO2培養箱內培養24 h，加入含有50 ng/ml FSH的無酚紅DMEM/F12培養基處理感染后的顆粒細胞。

5.放射免疫法測定孕酮：24孔板每孔中加入約5×105個顆粒細胞，用500 μl含15%FBS的DMEM/F12培養基于37℃、CO2培養箱內培養，然后進行相應處理。培養結束后收集細胞上清200 μl，儲存于-20℃，按照孕酮放射免疫分析試劑盒說明書測定孕酮的水平。

三、統計學分析

結 果

一、FSH誘導原代顆粒細胞分泌孕酮模型的建立

分離大鼠原代顆粒細胞后用生理鹽水和50 ng/ml的FSH分別處理24 h，通過放射免疫測定技術(RIA)分析FSH刺激顆粒細胞后的孕酮水平，結果顯示FSH處理細胞后孕酮水平顯著增加(P<0.001)(圖1)。

注：與生理鹽水處理組比較，***P<0.001圖1 FSH誘導顆粒細胞分泌孕酮結果

二、FSH對原代顆粒細胞miR-143表達的影響

用50 ng/ml的FSH分別處理原代顆粒細胞0、6、12、24和48 h后，應用實時定量RT-PCR方法檢測miR-143的表達量，以U6 snRNA的表達水平為內參，結果發現miR-143在FSH處理顆粒細胞6、12 h后表達沒有顯著變化，在24 h后表達顯著增加(P<0.01)，在48 h時表達量最高(P<0.001)(圖2)。

注：與未經FSH處理組比較，**P<0.01，***P<0.001圖2 FSH對原代顆粒細胞miR-143表達的影響

三、重組腺病毒過表達miR-143的鑒定

用對照重組腺病毒Ad-miRNC和Ad-miR143分別感染原代顆粒細胞后，通過實時定量RT-PCR方法檢測細胞內miR-143過表達水平，以U6 snRNA為內參。結果顯示，與對照Ad-miRNC組相比，感染Ad-miR143組的細胞miR-143表達水平顯著增加(P<0.01)(圖3)。

注：與對照重組腺病毒Ad-miRNC組比較，**P<0.01圖3 重組腺病毒Ad-miR143感染細胞后的miR-143表達結果

四、過表達miR-143對顆粒細胞孕酮分泌水平的影響

用對照重組腺病毒Ad-miRNC和Ad-miR143分別感染原代顆粒細胞后，加入50 ng/ml FSH再處理細胞24 h后，收集細胞上清檢測孕酮水平。結果表明，未經FSH處理的各組之間孕酮分泌水平沒有顯著差異。經FSH處理與未經FSH處理比較，各組孕酮分泌水平顯著升高(P<0.001)，且感染Ad-miR143組與空白對照組和對照腺病毒組相比，孕酮分泌水平顯著升高(P<0.01)(圖4)。

注：與未經FSH處理組比較，***P<0.001；與對照重組腺病毒Ad-miRNC組比較，##P<0.01圖4 miR-143過表達增加FSH刺激的顆粒細胞孕酮分泌

討 論

FSH受體(FSHR)是視紫紅素樣G蛋白偶聯受體家族的成員，特異性表達于卵巢顆粒細胞和睪丸支持細胞。FSHR以細胞內側的C末端結束，該末端包含受體的重要功能模體[11]。FSH促進卵泡的募集，支持腔卵泡的生長、成熟和選擇，通過與顆粒細胞上FSHR結合激活一系列信號級聯引發優勢卵泡排卵的生物學功能[12]。FSH與顆粒細胞上的FSHR結合，激活腺苷酸環化酶，提高細胞內環磷酸腺苷(cAMP)水平，并激活蛋白激酶A(PKA)，然后PKA可以直接磷酸化調節轉錄相關蛋白質包括Y盒結合蛋白1(YB-1)、組蛋白H3、cAMP響應原件結合蛋白(CREB)、β-連環蛋白(β-catenin)等，也可以間接激活以轉錄和翻譯為主要調控目標的信號轉導級聯，進而促進顆粒細胞增殖和甾體激素的合成[13]。

哺乳動物卵泡形成是一個復雜的過程，FSH是卵泡在竇期以后正常發育的關鍵，是卵泡存活的主要因素，通過激活多種信號通路調節卵泡成熟所需的基因[14]。卵泡發育過程伴隨顆粒細胞增殖和分化以及甾體激素的分泌。我們課題組前期用FSH處理KK-1顆粒細胞系，利用Northern blot方法檢測發現10 ng/ml FSH抑制了miR-143、let-7a、miR-125b的表達，提示FSH在顆粒細胞中的作用受miRNA的調控[9]。在本研究中，我們利用50 ng/ml FSH處理原代顆粒細胞，發現FSH處理24、48 h后上調miR-143的表達，這種差異可能與細胞類型和FSH處理劑量不同有關。張建芳等[15]利用原位雜交和實時定量PCR檢測小鼠卵巢，發現miR-143在顆粒細胞中的表達量約為卵母細胞中表達量的20倍，主要定位于各級卵泡的顆粒細胞。隨后他們證明從性交后15.5 d到產后4 d原始卵泡形成過程中，miR-143表達增加，原位雜交結果顯示miR-143定位于前顆粒細胞，并通過抑制前顆粒細胞增殖和下調細胞周期相關基因的表達來抑制原始卵泡的形成，表明miR-143對原始卵泡的形成至關重要[16]。這些研究提示miR-143通過調節顆粒細胞的增殖和功能參與卵泡的發育。Du等[17]發現FSHR是miR-143的靶基因，miR-143通過靶向下調FSHR的表達，降低細胞內PKA和AKT等信號分子水平，誘導豬顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖，研究進一步發現TGFβ信號分子SMAD4通過直接與miR-143的啟動子結合抑制miR-143的表達，從而正向調控FSHR的表達來參與顆粒細胞和卵泡發育調控。Zhang等[10]發現在小鼠卵巢中miR-143表達于初級、次級和竇性卵泡的顆粒細胞，并證明在FSH介導的小鼠顆粒細胞中miR-143沉默顯著增加雌二醇的產生和促進顆粒細胞的增殖，并且miR-143通過靶向調控KRAS實現對甾體激素合成相關基因的表達調控作用。Zhang等[18]證明在牛卵巢顆粒細胞中FSHR是miR-143的靶基因，miR-143通過下調FSHR的表達減少孕酮的合成和雌二醇的分泌。本研究發現miR-143過表達促進FSH介導的卵巢顆粒細胞孕酮的合成，提示FSH可能通過調控miR-143的表達調控顆粒細胞的功能。我們的結果進一步豐富了FSH對miRNA以及miRNA對顆粒細胞孕酮合成的調控。

綜上所述，本研究表明miR-143能夠促進FSH介導的卵巢顆粒細胞孕酮的分泌。我們將在上述研究的基礎上，探索miR-143調控孕酮生成的分子機制以及與FSH調控孕酮生成的其他已鑒定通路的關系，進一步揭示miR-143在卵巢顆粒細胞功能調控中的作用。