彩葉花卉礬根“紅貝露”的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究

陸錦明（上海市閔行區(qū)三農(nóng)綜合服務(wù)中心 201109）

礬根(Heuchera micrantha)又名珊瑚鈴，為虎耳草科礬根屬植物，原產(chǎn)于美洲中部，是一種多年生的彩葉花卉，其葉色豐富，有紅、綠、橙、紫等多種顏色；花小，呈鐘狀，花期在4月—6月；性耐寒，最低可耐-34 ℃低溫；幼苗長(zhǎng)勢(shì)較慢，成苗后生長(zhǎng)旺盛。由于礬根葉片顏色豐富，且會(huì)隨季節(jié)的不同而變化，被稱為“上帝調(diào)色板”，是稀有的優(yōu)良彩葉地被植物[1-4]，且在冬季溫暖地區(qū)葉子四季不凋，適合作花境、花壇、地被材料或庭院綠化材料。但由于很多礬根品種不結(jié)籽或種子細(xì)小而成苗困難，導(dǎo)致目前市場(chǎng)上優(yōu)良礬根品種供不應(yīng)求，且種苗價(jià)格較高，從而嚴(yán)重影響了優(yōu)良礬根品種的推廣應(yīng)用[4]。

研究表明，利用生物技術(shù)進(jìn)行礬根種苗的組織培養(yǎng)和快速繁殖研究，既可進(jìn)行優(yōu)良種苗的規(guī)模化繁育，又可克服礬根優(yōu)良品種數(shù)量少、短期內(nèi)無(wú)法快速推廣的缺點(diǎn)。目前，關(guān)于礬根組織培養(yǎng)的研究雖已有一些報(bào)道，但組培成功的品種較少，且不同品種間的差異較大[5-9]。在此背景下，筆者擬以礬根紅葉品種“紅貝露”的嫩葉葉柄為外植體，開(kāi)展礬根的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究，以期為礬根優(yōu)良種苗的規(guī)模化繁育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供驗(yàn)礬根品種為“紅貝露”，來(lái)自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所花卉溫室，取其幼苗葉片的葉柄作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒與培養(yǎng)

外植體的預(yù)處理：選取生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲害的礬根幼苗，于近基部剪取較嫩的葉片（帶葉柄），在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)剪去葉片，用洗潔精清洗后用流水沖洗30～60 min，用70%酒精浸15 s后用蒸餾水清洗。

外植體的消毒：消毒劑選用0.1%HgCl2和8%NaClO3，消毒時(shí)間分別為5、10、15 min，共設(shè)6個(gè)處理，每處理接種48個(gè)外植體。

消毒后在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌蒸餾水沖洗 5～6次，最后用無(wú)菌紗布吸干外植體表面的水分，接種于初始培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后每天觀察外植體污染情況，隨時(shí)去除污染材料。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)與不定芽分化

利用1.2.1中最優(yōu)的消毒方法消毒外植體，分別接種于不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基（植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類與濃度不同）上，見(jiàn)表2。每個(gè)處理接種48個(gè)外植體，每天觀察外植體污染情況，隨時(shí)去除污染材料。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，并置于光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的不定芽分化率。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

將不定芽分割為單芽，分別接種于不同增殖培養(yǎng)基上，見(jiàn)表3。每個(gè)處理接種6瓶，每瓶接種4個(gè)單芽。

1.2.4 試管苗的生根與移栽

生根培養(yǎng)：將叢生芽切割成單芽，分別接種于不同處理的生根培養(yǎng)基上，見(jiàn)表4。每個(gè)處理接種6瓶，每瓶接種6株。

試管苗移栽：將試管苗置于常溫下，在瓶中煉苗3～5 d，再打開(kāi)瓶蓋繼續(xù)煉苗1 d，然后用鑷子輕輕取出試管苗，洗凈其基部培養(yǎng)基后移栽于泥炭∶珍珠巖體積比為6∶1的基質(zhì)中，移栽后澆足定根水，蓋上塑料膜，以保溫保濕。

1.2.5 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽的分化、增殖培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，附加蔗糖3%；生根培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，附加蔗糖2%。所有培養(yǎng)基均按試驗(yàn)需要添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并附加瓊脂粉0.6%，pH均為5.8，均經(jīng)121 ℃、0.11 MPa的高溫高壓滅菌。

培養(yǎng)條件：愈傷組織誘導(dǎo)為黑暗培養(yǎng)；不定芽分化、增殖及生根培養(yǎng)均為光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為30～35μmol/(m2·s)，光照時(shí)間為12 h/d。培養(yǎng)室溫度為（24±2）℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

外植體的污染率，于接種后24 h至培養(yǎng)10 d后每天統(tǒng)計(jì)并累計(jì)；外植體的褐死率，于接種35 d后統(tǒng)計(jì)；愈傷組織誘導(dǎo)率，于外植體培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)；不定芽分化率，于愈傷組織光照培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)；增殖系數(shù)，于增殖培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)；試管苗根數(shù)、根長(zhǎng)及生根率，均于生根培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)；試管苗的移栽成活率，于移栽35 d后統(tǒng)計(jì)。

計(jì)算公式：污染率（%）=（污染的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)）×100，褐死率（%）=（褐化死亡的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)）×100，誘導(dǎo)率（%）=[誘導(dǎo)獲得愈傷組織的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)(去除污染數(shù)）]×100，不定芽分化率（%）=（分化不定芽的愈傷組織數(shù)÷光照培養(yǎng)的愈傷組織數(shù)）×100，增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)30 d后的有效芽數(shù)÷接種芽數(shù)，生根率（%）=（生根苗數(shù)÷接種苗數(shù)）×100，移栽成活率（%）=（移栽35 d后成活的試管苗數(shù)÷移栽試管苗數(shù)）×100。

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和多重比較分析（Duncan’s）。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方式對(duì)外植體培養(yǎng)的影響

由表1可知，消毒劑種類和消毒時(shí)間對(duì)外植體培養(yǎng)的污染及生長(zhǎng)情況影響較大。采用0.1%HgCl2消毒5 min時(shí)，外植體的污染率達(dá)22.9%，另有20.8%的外植體褐化死亡，成活率為56.3%；將0.1%HgCl2消毒時(shí)間延長(zhǎng)至10 min時(shí)，外植體的污染被控制了，但外植體的褐死率大幅提高，成活率較低，僅為33.3%；當(dāng)0.1%HgCl2消毒時(shí)間延長(zhǎng)至15 min時(shí)，外植體全部死亡。采用8%NaClO3消毒5 min時(shí)，外植體的污染率達(dá)70.7%；將8%NaClO3消毒時(shí)間延長(zhǎng)至10 min時(shí)，外植體的污染率大幅下降，僅為10.4%，成活率達(dá)81.3%，獲得了較好的消毒效果；將8%NaClO3消毒時(shí)間延長(zhǎng)至15 min時(shí)，外植體的污染率不變，但褐死率大幅提高，大大降低了外植體的成活率。綜合分析認(rèn)為，來(lái)源于溫室培育的礬根幼苗葉柄外植體，經(jīng)預(yù)處理后，采用8%NaClO3消毒10 min，是最佳的消毒處理方法。

表1 不同消毒方式對(duì)外植體成活的影響

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)與不定芽的分化

培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比對(duì)外植體的愈傷組織誘導(dǎo)及其不定芽的分化具有較大的影響。由表2可知，單加0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)愈傷組織；單加0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基僅能誘導(dǎo)少量愈傷組織，但質(zhì)量差不能分化出不定芽。培養(yǎng)基在含0.5 mg/L 6-BA的基礎(chǔ)上添加0.2～2.0 mg/L NAA，愈傷組織誘導(dǎo)率及其不定芽分化率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。其中，MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率分別為48.84%和28.57%；當(dāng)NAA濃度提高至0.5 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率分別提高至82.50%和69.70%；繼續(xù)提高NAA濃度至1.0 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率開(kāi)始下降，分別降為64.29%和55.56%。分析認(rèn)為，愈傷組織誘導(dǎo)與不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，在該培養(yǎng)基上，外植體暗培養(yǎng)15 d后開(kāi)始形成愈傷組織，培養(yǎng)30 d后愈傷組織逐漸長(zhǎng)大，并呈現(xiàn)半透明狀；在光照條件下，繼續(xù)培養(yǎng)2周后，部分愈傷組織開(kāi)始轉(zhuǎn)綠并逐漸分化形成不定芽，在光照條件下培養(yǎng)30 d，愈傷組織的不定芽分化達(dá)到高峰。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

2.3 增殖培養(yǎng)

由表3可知，在含IAA 0.1 mg/L的MS培養(yǎng)基上，6-BA濃度在0.1～1.0 mg/L范圍內(nèi)，礬根芽的增殖系數(shù)呈先增后降的趨勢(shì)，且各處理間差異達(dá)顯著水平。在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，礬根芽的增殖很慢，培養(yǎng)30 d后增殖系數(shù)僅為1.13；在MS+6-BA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 后可顯著提高其增殖系數(shù)，達(dá)2.88；繼續(xù)提高6-BA濃度至0.2 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)到最高值，為7.71，顯著高于其他處理；繼續(xù)提高6-BA濃度至0.5 mg/L，開(kāi)始出現(xiàn)玻璃苗現(xiàn)象，有效芽數(shù)比MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L處理減少，芽的增殖系數(shù)開(kāi)始降低，為6.41；繼續(xù)提高6-BA濃度至1.0 mg/L，增殖芽細(xì)弱且產(chǎn)生大量玻璃苗，芽的增殖系數(shù)顯著降低。綜合分析認(rèn)為，芽增殖的最適宜培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L，該培養(yǎng)基培養(yǎng)的芽叢生長(zhǎng)健壯、增殖快。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)芽增殖情況的影響

2.4 試管苗生根與移栽

由表4可知，生根培養(yǎng)基中，適當(dāng)添加IBA可有效提高其生根率和生根數(shù)。在不添加IBA的1/2 MS培養(yǎng)基上，試管苗培養(yǎng)2周左右有部分小苗開(kāi)始生根，但根系細(xì)弱、生長(zhǎng)差。在含IBA的培養(yǎng)基上，礬根試管苗培養(yǎng)7 d后基部就開(kāi)始長(zhǎng)出白色根；培養(yǎng)30 d后大部分試管苗能形成完整的根系，且添加低濃度的IBA(0.2 mg/L)，即可大幅度提高礬根“紅貝露”試管苗的生根率（從69.44%提高到91.67%）；當(dāng)培養(yǎng)基中IBA濃度提高到0.5～2.0 mg/L時(shí)，試管苗的生根率均達(dá)100%。培養(yǎng)基中IBA濃度在0.2～2.0 mg/L范圍內(nèi)，礬根“紅貝露”試管苗的平均單株生根數(shù)和根長(zhǎng)均呈先升后降的趨勢(shì)，其中，1/2 MS+IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)基的平均單株生根數(shù)和根長(zhǎng)均為最高，分別為23.33條和3.96 cm，當(dāng)IBA濃度提高至2.0 mg/L時(shí)，生根數(shù)和根長(zhǎng)均有所下降，平均單株生根數(shù)和根長(zhǎng)分別為15.33條和2.88 cm，且試管苗基部產(chǎn)生少量愈傷組織，并有部分幼苗的葉片發(fā)黃。綜合分析認(rèn)為，礬根“紅貝露”試管苗生根的適宜培養(yǎng)基是1/2 MS+IBA 1.0 mg/L，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管苗葉色較深，根系發(fā)達(dá)，植株生長(zhǎng)良好。

將來(lái)源于1/2 MS+IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)基的試管苗，經(jīng)煉苗后移栽，恢復(fù)生長(zhǎng)快，生長(zhǎng)勢(shì)良好，試管苗移栽成活率達(dá)95.33%。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)試管苗生根的影響

3 結(jié)論與討論

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，礬根組織培養(yǎng)一般以植株頂芽、莖尖、葉基組織等材料作為外植體進(jìn)行初始培養(yǎng)[5-10]，但這些方法對(duì)母株影響很大，有的甚至?xí)?duì)母株造成毀滅性傷害。本研究是以礬根葉柄作外植體，取材更容易，且對(duì)母株影響較小。

外植體消毒是建立無(wú)菌系的關(guān)鍵因子之一。HgCl2和NaClO3是組織培養(yǎng)中較常用的兩種消毒劑，前者毒性大，消毒效果較好，但受使用濃度和消毒時(shí)間影響較大，如果消毒劑的使用濃度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短很容易引起外植體污染，相反則容易殺死外植體而無(wú)法獲得無(wú)菌系，且對(duì)環(huán)境影響較大。本研究中，以礬根“紅貝露”幼嫩葉片的葉柄作為外植體，用HgCl2消毒易褐化死亡，效果不好；而經(jīng)流水沖洗30 min、70%酒精消毒20 s后，再用8%NaClO3消毒10 min，可獲得良好的消毒效果。該消毒處理方法對(duì)其它花卉進(jìn)行組培時(shí)的外植體消毒具有一定的借鑒意義。

葉柄外植體在MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上經(jīng)暗培養(yǎng)獲得愈傷組織后，將其轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng)條件下，愈傷組織又在同一培養(yǎng)基上分化不定芽，省去了不定芽分化培養(yǎng)基的配制及分化培養(yǎng)的轉(zhuǎn)接工作。

增殖系數(shù)是影響花卉組培繁育種苗效率的重要影響因子。一般情況下，適當(dāng)增加細(xì)胞分裂素濃度即可提高培養(yǎng)物的增殖系數(shù)，但濃度過(guò)高，易產(chǎn)生玻璃苗，減少有效芽數(shù)，從而影響組培苗的繁殖效率。本研究結(jié)果顯示，礬根“紅貝露”芽增殖的最適宜培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L，當(dāng)6-BA濃度高于0.5 mg/L時(shí)，容易出現(xiàn)玻璃苗，影響組培苗的繁殖效率。

試管苗的移栽成活率是植物組培技術(shù)能否真正應(yīng)用于生產(chǎn)的關(guān)鍵，而試管苗的生根質(zhì)量是影響其移栽成活率的主要影響因子。本研究結(jié)果顯示，礬根“紅貝露”試管苗生根的適宜培養(yǎng)基是1/2 MS+IBA 1.0 mg/L，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的礬根試管苗葉色較深，根系發(fā)達(dá)，經(jīng)煉苗后移栽，成活率達(dá)95.33%。

本研究建立了礬根的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)體系，不僅為規(guī)模化繁育礬根優(yōu)質(zhì)種苗提供了技術(shù)支撐，還為礬根優(yōu)良品種的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。