黑蕓豆肽飲料的研制

楊 旭，李 菁，孫先保，楊 柳，徐尚英，何述棟

（1.安徽新希望白帝乳業有限公司，安徽合肥 231600；2.合肥學院生物與環境工程系，安徽合肥 230009；3.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230009；4.安徽海神黃酒集團有限公司，安徽合肥 231561）

國際糧農組織的統計表明，蕓豆作為一種食用豆類作物，種植面積僅略低于大豆，位居第2位，廣泛分布于我國東北、華北、西北和西南等地區[1-3]。蕓豆的品種較多，根據顏色可分為白蕓豆、紅蕓豆、紫花蕓豆、黑蕓豆等。同時，蕓豆的營養也較為豐富，蛋白質含量約為23.1%，脂肪1.3%，碳水化合物56.9%，含鈣76 mg/100 g，以及豐富的B族維生素[4-5]，是一種比較難得的高鉀、高鎂、低鈉食品，氨基酸比例比較均衡[6]，可作為糧豆配合開發新營養主食品種的原料，也是雜糧釀酒制醬的主要來源。近年來的蛋白質功能性研究表明，白蕓豆蛋白質中含有一種天然的α-淀粉酶抑制劑[7-8]，可以用來治療肥胖癥和糖尿病等[9]，并含有受到醫學界廣泛重視的花色苷、皂苷等有效成分，不僅可以提高人體免疫力、增強人體抗病能力，還對腫瘤細胞增殖有抑制作用[10]。

與大分子蛋白相比，多肽具有可直接被機體吸收、消化利用率高、低免疫原性、促進代謝的特點[11-13]，不論在營養供給還是疾病治療方面都具有不可替代的作用[14]。然而，到目前為止，蕓豆蛋白的開發利用率還較低。以黑蕓豆蛋白為原料，采用酶解工藝制備黑蕓豆肽，并利用最佳水解條件下的產物研制具有抗氧化活性的黑蕓豆肽飲料，以期為蕓豆蛋白產業的綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

小黑蕓豆，黑龍江黑土小鎮現代農業開發有限公司提供；檸檬酸（食品級）、白砂糖；風味蛋白酶（15 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司提供；DPPH、無水乙醇、甲醛、氫氧化鈉，均為分析純。

PHS-3C型精密pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產品；752型紫外分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司產品；HH-4型數顯水浴鍋，常州國華電器有限公司產品；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑蕓豆肽的制備

選擇顆粒飽滿、無蟲害的黑蕓豆進行清洗，浸泡過夜，按料液比1∶8磨漿，過濾漿液，使其通過120目篩，分別收集豆漿和粗渣。將粗渣進行二次磨漿、分離，最后去除豆渣。將經上述處理后的黑蕓豆蛋白溶液水浴加熱至所需的溫度，調節pH值至設定值，加入相應量的蛋白酶低速攪拌酶解。酶解時間結束后，立即置于沸水浴中滅酶10 min，冷卻得到黑蕓豆肽溶液。

1.2.2 黑蕓豆肽飲料的制備

將上一步獲得的黑蕓豆肽溶液作為主要原料，加入適量的白砂糖、檸檬酸調味，進行均質處理，均質溫度為60～65℃，均質壓力為14.7 MPa，之后在121℃下殺菌15 min獲得終產品。

1.2.3 響應面試驗設計

根據Box-Beknhen中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，以酶添加量、酶解溫度、酶解時間為特征值（Xi），分別以酶解度和抗氧化性為響應值（Yi），設計三因素三水平響應面試驗，共17個試驗點，其中12個分析點、5個零點，零點試驗5次，以估計誤差。

響應面試驗設計因素及水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素及水平

1.2.4 正交試驗設計

根據前期的單因素試驗結果，對黑蕓豆肽添加量（W/W，%）、加糖量（W/W，%）、檸檬酸添加量（W/W，%）進行參數優化，設計L9（34）正交試驗。

黑蕓豆肽飲料配方優化正交試驗因素水平見表2。

1.3 評價方法

表2 黑蕓豆肽飲料配方優化正交試驗因素水平/%

1.3.1酶解度的測定——甲醛滴定法

用0.02 mol/L標準NaOH溶液滴定至溶液顯微紅色，計算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克數。計算公式如下：

式中：Vsample——待測液消耗標準NaOH溶液的體積；

Vcontrol——對照液消耗標準NaOH溶液的體積；

nNaOH——標準NaOH溶液的摩爾濃度。

1.3.2 抗氧化性的測定

用無水乙醇配置0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。配置0.5 mg/mL的維C溶液（作為對照組）。將測試樣品稀釋至不同濃度。將2 mL測試樣品溶液及2 mL DPPH溶液加入到同一試管中，搖勻，于室溫下暗處靜置30 min后測定其吸光度Asample，同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL溶劑混合后的吸光度Acontrol，以及2 mL測試樣品溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度Ablank。自由基清除能力的表示如下：

1.3.3 感官評價

選擇并培訓10名感官評定人員，在室溫下按參照GB 19302—2010制定的感官評分標準表。

黑蕓豆飲料感官品質評分見表3。

表3 黑蕓豆飲料感官品質評分

1.4 統計分析

所有試驗均平行測定至少3次，采用Design Expert 8.0.5.0軟件進行響應面結果分析，通過Excel 2016軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 黑蕓豆肽酶解條件的響應面分析

響應面試驗結果見表4。

表4 響應面試驗結果

使用Design Expert V 8.0.5.0軟件，對表4中數據進行回歸擬合，分別得到各響應值（Yi）對X1，X2，X3的回歸方程：

對以上回歸方程進行方差分析。

黑蕓豆酶解產物的酶解度回歸方程方差分析見表5。

表5 黑蕓豆酶解產物的酶解度回歸方程方差分析

由表5可知，黑蕓豆酶解產物的酶解度的模型回歸項極顯著 （p＜0.01），失擬項不顯著 （p＞0.05），說明方程擬合接近實際。回歸方程的相關系數R2=0.986 4，adjR2=0.968 9，說明試驗誤差小，模型各項均達到理想水平，可以較好地反映因素與響應值之間 的 關 系 。 方 程 中 X2， X3， X1X3， X2X3，，均為較顯著 （p＜0.05），X1，X1X2不顯著 （p＞0.05），說明試驗因子與響應值不是簡單的線性關系。對回歸方程進行中心標準化處理，根據回歸系數絕對值的大小得到各因素對酶解度的貢獻大小依次為X3（酶解時間） ＞X2（酶解溫度） ＞X1（酶添加量）。

黑蕓豆肽抗氧化性回歸方程方差分析見表6。

表6 黑蕓豆肽抗氧化性回歸方程方差分析

由表6可知，黑蕓豆肽抗氧化性的模型回歸項極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），說明方程擬合接近實際。回歸方程的相關系數R2=0.979 0，Adj R2=0.952 0，說明試驗誤差小，模型各項均達到理想水平，可以較好地反映因素與響應值之間的關系。方程中 X1，X2，X1X3，X2X3，均為較顯著 （p＜0.05），X3，X1X2不顯著 （p＞0.05），說明試驗因子與響應值不是簡單的線性關系。對回歸方程進行中心標準化處理，根據回歸系數絕對值的大小得到各因素對抗氧化性的貢獻大小依次為X2（酶解溫度） ＞X1（酶添加量） ＞X3（酶解時間）。

根據黑蕓豆肽酶解度和抗氧化性的響應面回歸方程做響應面圖，固定其中1個因素，考查另2個因素的交互作用。通過分析擬合響應曲面的形狀和等高線的疏密，分析各因素對該指標響應值的影響情況，并進一步確定黑蕓豆酶解的最佳工藝條件。

黑蕓豆蛋白酶解度響應面圖見圖1，黑蕓豆肽抗氧化活性響應面圖見圖2。

由圖1可見，隨著加酶量的增加，酶解度逐漸增大，當加酶量達到4%時，酶解度的增大趨于平緩；隨著酶解時間的延長，酶解度先增大后減小，當酶解時間為180 min時達到最大；隨著酶解溫度的增加，酶解度緩慢增大但不顯著，當酶解溫度達到50℃時，趨于最大值。由圖2可見，隨著酶添加量的增加，抗氧化性先增大后減小，當酶添加量為4%時，抗氧化性最好；隨著酶解時間的增加，抗氧化性緩緩增大，但斜率很小，當酶解時間為180 min時抗氧化活性的增長趨于停滯；隨著酶解溫度的提高，抗氧化性先增大后減小，當酶解溫度為50℃時，達到最大值。這說明黑蕓豆蛋白溶液的酶解度越高，其蛋白肽對DPPH自由基的清除能力越好，這與任海偉等人[15]的研究結果相一致。

綜合考慮各因素，最后確定酶添加量4%，酶解溫度50℃，酶解時間180 min為黑蕓豆肽酶解的最佳條件。

圖1 黑蕓豆蛋白水解度響應面圖

圖2 黑蕓豆肽抗氧化活性響應面圖

2.2 黑蕓豆肽飲料配方的正交結果分析

根據前期的單因素試驗結果，確定黑蕓豆肽添加量60%，白砂糖添加量13%，檸檬酸添加量0.03%為較優點，并在其附近取點進行正交試驗。

正交試驗結果見表7。

由表7可知，黑蕓豆肽、白砂糖、檸檬酸的添加量對黑蕓豆肽飲料的口感品質均有不同程度的影響，其中黑蕓豆肽添加量是影響飲料品質的顯著因子，各因素對黑蕓豆肽飲料口感品質影響的主次順序為A＞B＞C。最佳的配料比工藝參數為A2B3C2，即黑蕓豆肽添加量為60%，白砂糖添加量為15%，檸檬酸添加量為0.03%，在此配料比下，研制的黑蕓豆肽飲料的口感效果最佳。

對正交試驗結果進行極差分析。

正交試驗結果極差分析圖結果圖3。

表7 正交試驗結果

圖3 正交試驗結果極差分析圖

由圖3可知，極差分析結果與正交試驗表結果一致，各因素水平對因變量的影響較顯著。

3 結論

在前期單因素試驗的基礎上對黑蕓豆肽制備的酶解工藝進行了相應面優化，對黑蕓豆肽飲料的配方進行了正交優化。分別得到了酶解度和抗氧化性的響應面模型方程，回歸方差分析表顯示黑蕓豆酶解產物的水解度的模型、抗氧化性模型的回歸項均極顯著（p＜0.01），失擬項均不顯著（p＞0.05），各因素對酶解度的貢獻大小依次為X3（酶解時間）＞X2（酶解溫度）＞X1（酶添加量），對抗氧化性的貢獻大小依次為X2（酶解溫度） ＞X1（酶添加量） ＞X3（酶解時間）。綜合響應面圖分析得黑蕓豆肽制備的最佳酶解工藝為酶添加量4%，酶解溫度50℃，酶解時間180 min。采用L9（34）正交試驗表進行試驗，黑蕓豆肽飲料的正交優化結果表明，各因素對黑蕓豆肽飲料口感品質影響的主次順序為A＞B＞C。最佳的配料比工藝參數為A2B3C2，即黑蕓豆肽添加量為60%，白砂糖添加量為15%，檸檬酸添加量為0.03%，在此配料比下研制的黑蕓豆肽飲料的口感效果最佳。