檸檬酸-超聲波復合處理對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的抑制效果

額日赫木，張 琪，崔 娜，武晉海，宋小青

（山西師范大學食品科學學院，山西臨汾 041004）

馬鈴薯（Solanumtu berosum L.）是世界四大糧食作物之一，是維生素、礦物質、膳食纖維、碳水化合物和必需氨基酸的良好來源[1-2]，而且馬鈴薯的加工性能好，其加工產品的需求量也日益增加[3-4]。果蔬產品的外觀、質地、風味、營養、安全等與鮮切產品的品質有關，而產品外觀是影響人們選擇消費的主要因素[5]。馬鈴薯在鮮切加工過程中極易產生酶促褐變現象，這不僅使產品失去原有色澤，而且嚴重影響食用安全性。馬鈴薯酶促褐變主要是由于酪氨酸酶 （Polyphenol oxidase，PPO:EC 1.14.18.1） 催化氧化酚類化合物而生成黑色素物質所致[6]。在外界因素的影響下PPO分子活性往往會被激發，而酶活性變化主要取決于活性中心部位的暴露程度，也可能是活性中心某一區域結構改變而導致活性變化。此外，過氧化物酶（Peroxidase，POD） 在氧存在條件下，能迅速氧化酚類化合物，可與PPO協同作用引起馬鈴薯褐變[7]。

關于鮮切果蔬酶促褐變問題，國內外學者進行了大量的研究和探索，推動了防褐變技術的發展。從控制機理和方法來看，化學、物理和分子生物學方法是抑制酶促褐變的主要手段，其中化學方法的應用較為普遍[7]。檸檬酸（Citric acid，CA） 作為食品添加劑在食品工業中具有廣泛的應用基礎，它是一種有效的抗褐變劑，可通過酸化機制降低體系pH值抑制PPO活性，防止果蔬產品褐變[8]。近年來，非熱物理技術的興起為果蔬防褐變研究供了新的思路。它不僅有效抑制酶活性，而且改善了熱處理對食品營養成分和感官品質造成的不利影響[9-10]。如今人們更加青睞于使用低能耗、低成本、高度環保、高效率的非熱物理方法的使用[11]，如超聲波（Ultrasonic，US）技術，由于US能抑制腐敗微生物的生長，并使多種變質酶失活而維持食品的品質，體現了它的應用價值和商業價值[12]，因而得到了研究者的廣泛關注。US技術最早應用于降解高分子化合物的研究中，如降解淀粉使其分子量降低且趨于某一特定范圍，同時使淀粉顆粒的粒徑減小[13]。US處理可以改善一些蛋白質的物理特性。例如，增加大豆蛋白的表面活性和乳化性等[14]。近年來，US在果蔬防褐變研究中也得到了較好的應用，它對酶的作用機理比較復雜,普遍認為空化作用、熱效應和機械作用是促使酶活性變化的原因，其中空化作用尤為關鍵[15]。研究證明，在不同處理條件下US對酶類活性可產生不同的影響，如適當的頻率、功率、時間等可以實現酶活性的降低或滅活[15-18]，這為US技術在鮮切果蔬防褐變領域中的應用提供了依據。

目前，物理和化學相結合的形式已成為抑制鮮切果蔬褐變的熱點方法，但遺憾的是，US與CA復合方法的研究還未有報道。因此，試驗將利用CA-US復合處理鮮切馬鈴薯，試圖抑制PPO和POD活性，進而減少鮮切馬鈴薯酶促褐變，以期為果蔬防褐變研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯，冀張8號，購于山西臨汾堯豐市場，于4℃下貯藏；鄰苯二酚（分析純），南京化學試劑股份有限公司提供；檸檬酸（食品級），上海寶豐生化有限公司提供；愈創木酚（分析純），上海源葉生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要儀器設備

752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產品；FS-1200N型超聲波處理器，上海生析超聲波有限公司產品；H1805R型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品；LC-Q01型切片機，佛山市順德區韓泰電器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 主要溶液的配制

磷酸緩沖液的配制：稱取35.8 g磷酸氫二鈉和15.6 g磷酸二氫鈉，溶解于不同燒杯中并分別定容至1 000 mL，再將上述溶液混合并測定其pH值，最終得到濃度0.1 mol/L，pH值6.8的磷酸緩沖液。

鄰苯二酚溶液的配制：稱取0.110 1 g鄰苯二酚于燒杯，充分溶解后移入50 mL的容量瓶中定容，得到濃度為0.02 mol/L鄰苯二酚溶液（現配現用）。

愈創木酚溶液的配制：稱取10.02 g愈創木酚，移入500 mL容量瓶中，加入489.98 g蒸餾水充分溶解并混勻后得到2%愈創木酚溶液（于4℃下貯藏）。

1.2.2 試驗設計

鮮切馬鈴薯的CA-US復合處理，馬鈴薯經過清洗去皮、切片（厚度為0.3 cm）后，置于裝有300 mL CA溶液的燒杯中，放置于超聲處理裝置（圖1）中，按表1進行CA-US復合處理。考查超聲時間、超聲功率、CA溶液質量分數對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性產生的影響，并篩選出最佳條件。

超聲波處理裝置見圖1，CA-US復合處理條件的設定見表1。

圖1 超聲波處理裝置

表1 CA-US復合處理條件的設定

1.2.3 PPO和POD活性在貯藏期間內的變化

將CA-US復合處理和未處理的鮮切樣品置于室溫（20℃）下貯藏，考查CA-US復合處理和未處理的馬鮮切鈴薯PPO和POD活性在貯藏時間內180 min的變化。同時，利用全自動色彩色差儀測定CA-US復合處理和未處理鮮樣品在0和180 min時的顏色變化，包括L*值、a*值、b*值、△E值的變化。

1.2.4 PPO和POD活性的測定

提取粗制酶溶液，將馬鈴薯塊莖洗凈、切丁，然后稱取5 g樣品，加入30 mL磷酸緩沖液（pH值6.8）進行研磨，再裝入離心管內離心（轉速10 000 r/min，時間15 min，溫度4℃）即可得到粗制酶溶液。

PP0活性的測定是參照孫程旭等人[19]和Aydin N等人[20]的方法并稍作改動。依次量取2 mL的磷酸緩沖液（pH值6.8）、1 mL的鄰苯二酚溶液、1 mL粗制酶溶液加入到10 mL試管中，并在30℃恒溫水浴鍋中預熱5 min。待預熱結束后，將反應液迅速移入比色皿中，在波長410 nm處測定其吸光度，每隔30 s讀數1次，測定4 min內的吸光度變化。POD活性的測定是參照孫程旭[19]的方法進行測定。（酶活性的定義：以單位毫升酶液，每分鐘內吸光度每增加0.001為1個活力單位。）

1.2.5 統計分析

各組循環處理5次，取平均值，采用Excel 2007進行統計分析，利用IBM SPSS 20.0軟件進行顯著性方差分析，組間比較采用單因素方差分析，以p＜0.05為差異有統計學意義。數據表現形式為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 CA-US復合處理對馬鈴薯PPO和POD活性的影響

超聲時間對鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響見圖2。

圖2 超聲時間對鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性均呈現先下降后上升的趨勢。單一的檸檬酸溶液處理（此時超聲功率和時間均為0）時，雖然PPO和POD活性與未處理相比均有降低（p＜0.05），然而可以看出 CA-US復合處理 （2.5～12.5 min）的效果明顯優于前者。當超聲時間增加至7.5 min時，PPO和POD顯示最低活性，即分別為43.94（U） 和3.57（U），這與未處理相比，其PPO和POD活性分別降低了71.4%和86.4%（p＜0.05）。當超聲時間達到12.5 min時，其PPO和POD活性均出現了上升趨勢，并與7.5 min時相比，其活性差異明顯（p＜0.05）。由于連續的超聲波場致效應改變了PPO和POD分子結構而提高了其活性，也促使酶活性中心更多地暴露并與底物結合[15，21]。由此可見，過長的超聲處理時間反而促使酶活性逐漸上升，而不同的超聲處理時間對于PPO和POD活性的影響也是不同的。此外，超聲波在α-淀粉酶[21]和木瓜蛋白酶[22-23]等相關研究中也顯示，超聲處理條件是決定酶活性產生變化的重要因素，在適當的超聲處理時間下可以改變酶學活性，并同時取決于酶的種類。

超聲功率對鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響見圖3。

圖3 超聲功率對鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性均呈現先下降后上升的趨勢。當超聲功率達到360 W時，PPO和POD顯示最低活性，即分別為44.9（U） 和3.5（U），這與未處理相比，其PPO和POD活性分別降低了69.7%和86%（p＜0.05）。當超聲功率增加至600 W與360 W時，其PPO和POD活性均有不同程度的提高。結果表明，不同的超聲功率對PPO和POD活性產生的影響也是不同的，而CA-US復合處理與單一檸檬酸處理（此時超聲功率和時間均為0）相比，對PPO和POD活性的抑制效果更佳。不同種類的酶在不同的超聲處理條件下，其活性變化是不同的，如木瓜蛋白酶在超聲功率為40W時，其活性提高了9%[22]；而POD，ATP酶活性會隨著超聲功率的持續增加而降低[23]。一般認為酶活性的高低主要與其分子空間結構的合理程度有關，而高強度超聲處理樣品時會產生瞬態空化作用、熱效應、機械作用，酶分子在強大的剪切力和沖擊波的作用下，分子高級結構可能被改變[25]，如二級結構的組成變化、結構域的構型、三級結構次級鍵的斷裂、分子形態變化等都可能是酶活性被改變的原因。在超聲波的作用下可能增加了馬鈴薯片與檸檬酸溶液的接觸頻率，繼而使介質環境pH值迅速降低、使檸檬酸螯合酶活性中心金屬離子的能力提高，從而使酶活性降低。

檸檬酸溶液質量分數對鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響見圖4。

圖4 檸檬酸溶液質量分數對鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響

由圖4可知，隨著檸檬酸溶液（超聲介質）質量分數的增加，CA-US復合處理與未處理的鮮切馬鈴薯，其PPO和POD活性均呈現下降的趨勢。而略有不同的是POD活性在0.25%以下時，并未呈現顯著差異（p＞0.05）。總體來看，CA-US復合處理與單一的超聲波處理（此時檸檬酸質量分數為0） 相比，對其PPO和POD活性的抑制效果更佳。當檸檬酸質量分數增加至1%時，PPO和POD呈現最低活性，而與未處理相比，分別降低了69.2%和77%（p＜0.05）。當檸檬酸質量分數加至1.5%時，其PPO和POD活性與1%時相比，并沒呈現顯著性差異（p＞0.05），這表明其他條件不變，而檸檬酸質量分數增加至一定值后，其PPO和POD活性趨于穩定。結果證明，CA-US復合處理，能夠有效抑制鮮切馬鈴薯PPO和POD活性。如前所述，這不僅與超聲波場致效應有關，而且介質的pH值變化也有助于PPO和POD活性的改變。一般引起酶促褐變的最適宜pH值范圍在4～7，因此降低介質中的pH值可以抑制酶的催化活性。如果介質中的pH值在3以下，酶的催化活性幾乎可以達到最低值或喪失[26]。另一方面，檸檬酸的3個羧基有較強的鰲合酶活性中心金屬離子的能力，從而使酶活性降低。因此，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的變化，可認為是檸檬酸和超聲波協同作用的結果。

2.2 貯藏時間對鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響

貯藏時間對鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響見圖5。

由圖5可知，在貯藏時間0～180 min時，CA-US復合處理與未處理的鮮切馬鈴薯PPO活性，均呈現先上升而后下降的趨勢。當貯藏時間增加至30 min時，與0 min時相比，其PPO活性顯著增大（p＜0.05）。貯藏時間超過30 min時，其PPO活性逐漸降低，而增加至180 min時均不再降低而趨于穩定。同時，在貯藏時間0～180 min內，鮮切馬鈴薯POD活性也呈現先上升而后下降的趨勢。在貯藏時間為30 min時，未處理的樣品POD活性達到最高值，隨后開始逐漸降低，并在120～180 min內趨于穩定。而經CA-US復合處理的樣品，其POD活性在貯藏時間為90 min時達到最高值，當增加至150 min時，其活性趨于穩定。總體來看，經過CA-US復合處理的樣品，在貯藏時間0～180 min內，其PPO和POD活性均低于未處理樣品。

貯藏時間對鮮切馬鈴薯三刺激值及總色差的影響（20℃） 見表2。

表2 貯藏時間對鮮切馬鈴薯三刺激值及總色差的影響（20℃）

由表2可知，貯藏時間為180 min時與0 min時相比，未處理的鮮切馬鈴薯的a*值顯著增加（p＜0.05），而經過CA-US復合處理的鮮切馬鈴薯則顯著降低（p＜0.05）。a*值（正值） 越大說明紅色指數增加，褐變程度也在增大。同時，未處理的鮮切樣品在180 min時與0 min相比，其L*值顯著降低（p＜0.05），而CA-US處理的鮮切樣品并沒有顯著變化（p＞0.05）。L*值的減少說明白色指數在減少，樣品顏色變深。

綜上所述，通過CA-US復合處理，可以有效降低鮮切馬鈴薯的PPO和POD活性而抑制酶促褐變，從而減少馬鈴薯在加工過程中的損失，這一結果也已通過貯藏試驗得到了證明。

3 結論

研究表明，通過CA-US復合處理，可以有效抑制鮮切馬鈴薯PPO和POD活性，繼而減少馬鈴薯在加工過程中因酶促褐變造成的損失。相對于單一的化學和物理方法，CA-US復合處理方法對PPO和POD活性的抑制效果更佳，而物理和化學方法的協同作用可能是其酶活性降低的主要原因。通過貯藏試驗發現，在貯藏前期馬鈴薯PPO和POD活性略有升高，而在后期逐漸降低。在貯藏時間內，經CA-US復合處理的樣品PPO和POD活性，均低于未處理的樣品。這表明，經CA-US復合處理的鮮切馬鈴薯在貯藏期間不會產生明顯的褐變現象，而這一結果已通過貯藏期間的顏色變化得到了證明。在試驗中，CA-US復合處理條件的篩選是關鍵環節，此研究的后續工作中還需進一步優化處理條件，并需要對CA-US復合處理的協同作用進行系統的分析。