高效液相色譜法測定蜂膠中的六種黃酮

霍麗斯 ， 劉嘉亮 ，陳穎芯

（1.華南理工大學，廣東廣州 510000；2.廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東廣州 510000；3.廣東藥科大學，廣東廣州 510000）

蜂膠，又被稱為“紫色黃金”，是蜜蜂從植物芽孢或樹干上采集的樹脂，混入蜜蜂口器中腺體的分泌物，再和花粉、蜂蠟加工制成的一種膠狀物質，是蜂巢的保護傘[1]。蜂膠具有多種生物學功能，其中發揮重要作用的生物活性物質就是黃酮類物質[2]。主要研究的6種黃酮化合物分別為蘆丁、莰菲醇、芹菜素、松屬素、苛因和高良姜素。黃酮化合物作為蜂膠的主要功效成分，也使得蜂膠具有較強的天然抗氧化性能、抑菌活性、抗病毒和抗癌等多種生物學功能和藥理學作用，能夠增強機體免疫并治療多種疾病[3-4]。黃酮類化合物的含量也因此常被作為評價蜂膠質量的指標之一[5]。因此，尋求一種高效、快速、準確的檢測蜂膠中黃酮類物質的測定方法有著重要的意義。目前，黃酮類化合物含量的測定方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜法、紙色譜PC和薄層色譜TLC法、熒光測定法、原子吸收光譜法、近紅外漫反射光譜法、共振散射光譜法、薄層掃描法和單掃示波極譜法等，其中最常用的就是紫外分光光度法和高效液相色譜法，其他方法使用頻率不高[6]。試驗研究不同體積比甲醇-水溶液對蜂膠中6種黃酮的提取效果，通過對空白樣品加標，借助高效液相色譜法-紫外檢測器測定回收率，以尋找合適提取液的濃度。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290型超高效液相色譜儀；PL203型分析天平，梅特勒-托利多公司產品；JP-C600超聲波水浴儀，廣州市吉普超聲波電子設備有限公司產品；渦旋混合器；移液槍 （20～200，100～1 000 μL）。

蘆丁、莰菲醇、芹菜素、松屬素、苛因和高良姜素標品（99.0%），德國SIGMA公司提供；甲醇、乙腈，均為色譜純；磷酸，分析純；二級水。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

將蘆丁、莰菲醇、芹菜素、松屬素、苛因和高良姜素標準品用甲醇配制成100 μg/mL混合標準溶液，再用甲醇∶水（1∶1） 依次稀釋配成0.2，1.0，5.0，10，20，50 μg/mL 6個不同質量濃度的標準工作溶液于進樣瓶中，在渦旋混合器上充分渦旋混勻，待測。

1.2.2 樣品的前處理

稱取0.1 g（精確到0.000 1 g） 混合均勻的蜂膠樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入25 mL甲醇溶液，充分搖勻并在渦旋混合器上渦旋混合20 s，于超聲波水浴中超聲處理20 min，取出加入15 mL純水，充分搖勻，于超聲波水浴中再超聲處理20 min，取出冷卻至室溫，將試樣溶液轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇少量多次洗滌聚丙烯離心管并在渦旋混合器上充分渦旋，將洗滌液一并轉移到100 mL容量瓶內，最后用60%的甲醇+水定容至刻度。充分搖勻后，用注射過濾器將試樣溶液通過有機系濾膜過濾至進樣瓶中，在渦旋混合器充分渦旋后，供超高效液相色譜儀測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Aglient5 TC-C18（2）型，250 mm×4.6 mm；進樣量20 μL，柱溫40℃，流速0.80 mL/min，檢測波長：莰菲醇、芹菜素、苛因、高良姜素270 nm；蘆丁255 nm，松屬素225 nm；流動相A：甲醇，流動相B：二級純水（用磷酸調節pH值3）。色譜分離梯度條件如下：T=0.00 min時，A為40%，B為60%；T=10.0 min時，A為40%，B為60%；T=13.0 min時，A為55%，B為45%；T=25.0 min時，A為70%，B為30%；T=31.0min時，A為40%，B為60%；T=35.0 min時，A為40%，B為60%，流量均為0.800 mL/min。

2 結果與分析

2.1 方法的線性和檢出限

為了提高方法的可靠性和結果的準確度，采用標準加入法，以樣品含量為本底，分別加入各物質本底含量的0，1，2，5，10倍的標準品，按照1.2.2的前處理方法進行處理，在1.2.3的色譜條件下進行定性定量測定。結果表明，蘆丁、莰菲醇、芹菜素、松屬素、苛因和高良姜素均在0.2～50.0 μg/mL質量濃度范圍內呈良好線性關系，相關系數（R2）均大于0.999。采用加標方式考查方法檢出限，以S/N≥3作為方法檢出限，得到蘆丁、莰菲醇、芹菜素、松屬素、苛因和高良姜素檢出限均為0.1 g/kg。

線性和檢出限見圖1，蜂膠樣品測定見表1。

圖1 線性和檢出限

表1 蜂膠樣品測定

2.2 精密度

按照1.2的樣品前處理方法稱取6份混合均勻的蜂膠樣品，加標含量為樣品本底含量的1倍，進行6次平行測定試驗，測定結果表明該方法精密度良好。

蜂膠精密度試驗結果見表2。

表2 蜂膠精密度試驗結果

2.3 回收試驗

試驗選取蜂膠作為樣品和6種不同體積分數甲醇溶液（0，10%，20%，40%，60%，80%，100%甲醇）作為提取液；加標量是本底的1，2，5，10倍（蜂膠本底蘆丁為20 mg/g，莰菲醇為0.8 mg/g，芹菜素為0.3 mg/g，松屬素為3.0 mg/g，苛因為2.0 mg/g，高良姜素為4.0 mg/g）每個質量濃度做5個平行，按照 1.2的方法處理樣品，最后供超高效液相色譜儀測定。每個質量濃度的回收率結果以平均值表示。

5倍本底加標量6種黃酮物質的回收率見圖2。

圖2 5倍本底加標量6種黃酮物質的回收率

3 結論

由試驗結果可看出，以60%的甲醇-水提取蜂膠中6種黃酮物質取得較好的提取效率，以甲醇和水（用磷酸調節pH值3）為流動相進行梯度洗脫取得較好的分離效果，回收率均達到85%以上，滿足實驗室測定要求。該方法準確可靠、穩定性高、操作簡便，可滿足對于不同蜂膠制品中6種黃酮含量的判斷，具有現實意義。