甘草中黃酮類化合物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究Δ

張 霞 ，張 芳 ，趙建軍 ，雍婧姣 ，高曉娟 ，張文華 ，王漢卿 #（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川75000；2.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 75000；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 21002；.百瑞源枸杞股份有限公司，銀川 750299）

甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、防治病毒性肝炎、降血糖、降血壓等作用；甘草的化學(xué)成分較復(fù)雜，主要為黃酮類、皂苷類、生物堿類和多糖類化合物，其中，黃酮類化合物是甘草中最重要的化學(xué)成分之一[2-4]。近年來，針對(duì)甘草黃酮類化合物藥理作用的研究不斷深入，但是其藥效學(xué)和作用機(jī)制尚不完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network pharmacology）是通過分析基因、蛋白、疾病、藥物等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息資料，利用專業(yè)分析軟件及算法，整體、系統(tǒng)地揭示藥物、靶點(diǎn)蛋白、疾病之間的關(guān)聯(lián)，從網(wǎng)絡(luò)層面預(yù)測(cè)藥物對(duì)疾病的干預(yù)與影響。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)整體觀相契合[5-6]。故本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)與方法，分析甘草中黃酮類化合物的靶點(diǎn)蛋白和作用通路，預(yù)測(cè)其可能存在的藥理作用和作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究甘草的藥效學(xué)、藥理學(xué)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

中藥整合藥理學(xué)計(jì)算平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)Pub-Chem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.5.1（http：//www.cytoscape.org）；藥效團(tuán)匹配與潛在識(shí)別靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)PharmMapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID V 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）。

1.2 甘草中黃酮類化合物的收集與篩選

依據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，結(jié)合柱色譜分離得到并經(jīng)核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等分析手段確認(rèn)的甘草黃酮類化合物。采用ChemBioDraw Ultra 14.0軟件獲取每個(gè)化合物相對(duì)分子質(zhì)量和脂水分配系數(shù)信息，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取氫鍵給體數(shù)目和氫鍵受體數(shù)目，根據(jù)化合物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中口服生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18的標(biāo)準(zhǔn)[9]，篩選出候選化合物，并下載各化合物的分子結(jié)構(gòu)式，保存為MDL SDfile（*.sdf）文件格式，備用。

1.3 甘草中主要黃酮類化合物潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將上述文件格式為*.sdf的化合物導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將目標(biāo)靶點(diǎn)設(shè)為“Human protein targets only”，靶點(diǎn)匹配值設(shè)為100，獲取靶點(diǎn)蛋白的數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符（PDB ID）、靶點(diǎn)名稱（Target name）、匹配值（Fit score）等信息。其中匹配值為分子和靶點(diǎn)的匹配度，取匹配值排名前10位的作為該化合物的重要靶標(biāo)蛋白。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符找到相對(duì)應(yīng)的蛋白編號(hào)Uniprot，同時(shí)獲取這些靶點(diǎn)相應(yīng)的基因名稱。

1.4 通路注釋和分析

采用DAVID V 6.8分析工具對(duì)獲得的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)確定重要通路，對(duì)該通路進(jìn)行注釋和分析。并進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）生物過程富集，分析GO生物過程（以P＜0.05判斷相關(guān)）。

1.5 甘草中黃酮類化合物-靶點(diǎn)-通路關(guān)系分析

將篩選到的甘草中主要黃酮化合物預(yù)測(cè)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建甘草黃酮類化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖由化學(xué)成分、蛋白、通路3個(gè)部分組成。從軟件輸出“Default node”數(shù)據(jù)，摘錄“Degree”和“Name”項(xiàng)。選出“Degree”分別排位前10的化合物、蛋白和通路進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 甘草中主要黃酮類化合物的篩選結(jié)果

根據(jù)方法中設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共有19個(gè)化合物符合要求，具體信息見表1。

2.2 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

甘草中19個(gè)主要黃酮類化合物共涉及78個(gè)作用靶點(diǎn)蛋白（共188次），其中細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白2（Cellular retinoic acid-binding protein 2）、腦啡肽酶（Neprilysin）、甲狀腺素運(yùn)載蛋白（Transthyretin）、醛糖還原酶（Aldose reductase）等靶點(diǎn)蛋白出現(xiàn)的頻數(shù)較高，排名前40的甘草中主要黃酮類化合物的潛在靶點(diǎn)信息結(jié)果見表2。

表1 甘草中主要黃酮類化合物的具體信息Tab 1 Detail information of main flavonoids from G.uralensis

續(xù)表1Continued tab 1

2.3 甘草中主要黃酮類化合物潛在靶點(diǎn)蛋白的通路分析結(jié)果

運(yùn)用DAVID V 6.8分析工具對(duì)甘草中主要黃酮類化合物78個(gè)靶點(diǎn)蛋白的KEGG通路進(jìn)行分析，共得到40條重要通路（P＜0.05）。用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)通路進(jìn)行注釋和分析發(fā)現(xiàn)，與癌癥相關(guān)的通路8條，與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的通路7條，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的通路6條，與傳染病相關(guān)的通路5條，與代謝相關(guān)的通路3條，與細(xì)胞代謝過程相關(guān)的通路3條，與免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路2條，與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的信號(hào)通路2條，與消化系統(tǒng)相關(guān)的信號(hào)通路1條，與發(fā)育有關(guān)的通路1條，另外有2條通路沒有明確的分類歸屬。甘草中主要黃酮類化合物的潛在作用通路分析結(jié)果見表3。

2.4 GO生物過程富集分析結(jié)果

GO生物過程富集分析結(jié)果顯示，靶點(diǎn)蛋白參與的生物過程主要有代謝過程（77個(gè)靶點(diǎn)，43.5%）、單有機(jī)體過程（77個(gè)靶點(diǎn)，43.5%）、生物調(diào)節(jié)（67個(gè)靶點(diǎn)，37.9%）、刺激反應(yīng)（63個(gè)靶點(diǎn)，35.6%）、生物過程調(diào)節(jié)（63個(gè)靶點(diǎn)，35.6%）、多有機(jī)體生物過程（51個(gè)靶點(diǎn)，28.8%）、生物信號(hào)（47個(gè)靶點(diǎn)，26.6%）、發(fā)育過程（46個(gè)靶點(diǎn)，26.0%）、免疫系統(tǒng)過程（19個(gè)靶點(diǎn)，16.4%）、生長(zhǎng)過程（14個(gè)靶點(diǎn)，7.9%）、生殖過程（14個(gè)靶點(diǎn)，7.9%）、繁殖（14個(gè)靶點(diǎn)，7.9%）等，表明甘草中主要黃酮類化合物參與體內(nèi)多種生物過程。甘草中主要黃酮類化合物的GO生物過程富集分析結(jié)果見圖1。

表2 排名前40的甘草中黃酮類化合物的潛在靶點(diǎn)信息Tab 2 Information of potential targets of the flavonoids from G.uralensis in the top 40

2.5 甘草中主要黃酮類化合物-靶點(diǎn)蛋白-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果

甘草中主要黃酮類化合物通過不同的靶點(diǎn)蛋白在不同的信號(hào)通路中發(fā)揮作用，化學(xué)成分、靶點(diǎn)和通路間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這與中藥“多成分、多靶點(diǎn)”的特性相一致。甘草苷、甘草素、異甘草素等15個(gè)化合物在網(wǎng)絡(luò)中的連接度較高，提示可能是甘草發(fā)揮藥效作用的重要黃酮類化合物；GTPase HRas酶等10個(gè)靶點(diǎn)蛋白在78個(gè)作用靶標(biāo)中的連接度較高，可能是甘草中主要黃酮類化合物潛在的主要作用靶點(diǎn)；在40條通路中，癌癥通路（S2）、胰島素信號(hào)通路（S1）等13條通路是甘草中主要黃酮類化合物的主要信號(hào)通路。甘草中主要黃酮類化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。在網(wǎng)絡(luò)圖中，每個(gè)化合物、靶點(diǎn)、信號(hào)通路為一個(gè)“節(jié)點(diǎn)”，“邊”是一種聯(lián)系，節(jié)點(diǎn)的“連接度”是與之相連的邊的數(shù)目。連接度越大，表明化合物通過該靶點(diǎn)發(fā)揮的治療作用越大。Degree排位前10的各主要節(jié)點(diǎn)的連接度見表4。

表3 甘草中主要黃酮類化合物的潛在作用通路Tab 3 Potential pathways for main flavonoids from G.uralensis

圖1 甘草中主要黃酮類化合物的GO生物過程富集分析結(jié)果Fig 1 GO biological process analysis of the main flavonoids from G.uralensis

圖2 甘草中主要黃酮類化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Flavonoids-target-pathway network of G.uralensis

表4 各主要節(jié)點(diǎn)連接度Tab 4 The Degree of each main node

3 討論

3.1 甘草中黃酮類化合物的作用靶標(biāo)

甘草中19個(gè)主要黃酮類化合物共涉及78個(gè)作用靶點(diǎn)蛋白，其中GTPase HRas酶（蛋白編號(hào)：P01112）、促分裂素原活化蛋白激酶10（Mitogen-activated protein kinase 10，蛋白編號(hào)：P53779）、3-磷酸依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，蛋白編號(hào)：O15530）、促分裂素原活化蛋白激酶14（Mitogen-activated protein kinase 14，蛋白編號(hào)：Q16539）、糖原合成酶激酶（Glycogen synthase kinase-3 beta，蛋白編號(hào)：P49841）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，cytosolic，蛋白編號(hào)：P35558）、cAMP依賴性蛋白激酶（cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha，蛋白編號(hào)：P00517）、胰島素受體（Insulin receptor，蛋白編號(hào)：P06213）、視黃酸受體RXR-α（Retinoic acid receptor RXR-alpha，蛋白編號(hào)：P19793）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（Hepatocyte growth factor receptor，蛋白編號(hào)：P08581）在78個(gè)作用靶標(biāo)中的連接度較高，可能是甘草中黃酮類化合物分潛在的主要作用靶點(diǎn)。

3.2 甘草中黃酮類化合物的信號(hào)通路

在40條信號(hào)通路中，癌癥通路（S2）、PI3K-Akt信號(hào)通路（S4）、胰島素信號(hào)通路（S1）、癌癥的蛋白多糖通路（S7）、胰島素抵抗（S3）、黏著斑（S11）、Ras信號(hào)通路（S17）、小細(xì)胞肺癌（S5）、FoxO信號(hào)通路（S8）、Rap1信號(hào)通路（S26）連接度較高，是甘草中黃酮類化合物發(fā)揮作用的主要信號(hào)通路。

3.3 甘草中黃酮類化合物的藥理作用分析與預(yù)測(cè)

經(jīng)甘草中黃酮類化合物-靶點(diǎn)蛋白-信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，抗腫瘤作用可能是甘草中黃酮類化合物最主要的藥效作用之一。Zhao HX等[10]研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素可通過抑制M2巨噬細(xì)胞極化而降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率；異甘草素還能夠通過活化c-Jun氨基末端激酶及抑制胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶而抑制人腺樣囊性癌移植瘤血管的新生，進(jìn)一步抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[11]。光甘草定能夠通過抑制FAK/rho信號(hào)通路而顯著抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖及血管再生[12]。光甘草定還可對(duì)抗紫外線輻照人角質(zhì)化細(xì)胞而產(chǎn)生氧化的DNA碎片，防止陽(yáng)光引起皮膚衰老和皮膚癌[13]。甘草查爾酮A可阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)其凋亡從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。上述文獻(xiàn)報(bào)道與甘草中黃酮類化合物網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果相同。此次研究顯示，GTPase HRas酶、促分裂素原活化蛋白激酶10、3-磷酸依賴性蛋白激酶1、促分裂素原活化蛋白激酶14、cAMP依賴性蛋白激酶、視黃酸受體RXR-α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體等靶點(diǎn)蛋白在癌癥信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。

甘草中黃酮類化合物網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果提示，抗糖尿病作用可能是甘草中黃酮類化合物的另一主要藥理作用。Gaur R等[15]研究表明，甘草素和異甘草素的衍生物在小鼠口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)中可顯著降低血糖值。Guo ZH等[16]研究發(fā)現(xiàn)，12種甘草黃酮化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶及蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP-1B）具有明顯的抑制作用，表明甘草黃酮是可用于預(yù)防和治療2型糖尿病的潛在成分。上述文獻(xiàn)報(bào)道也與本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果一致。研究顯示，GTPase HRas酶、促分裂素原活化蛋白激酶10、3-磷酸依賴性蛋白激酶1、糖原合成酶激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、cAMP依賴性蛋白激酶、胰島素受體等靶點(diǎn)蛋白在胰島素信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，甘草中黃酮類化合物具有神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用也與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[17-18]。

一直以來，甘草的抗傳染病作用研究，尤其是抗肝炎病毒作用研究多以甘草中的皂苷類成分甘草酸及其衍生物為主，目前上市藥品有甘草酸二銨注射液及膠囊，適用于伴有轉(zhuǎn)氨酶升高的急、慢性病毒性肝炎的治療。甘草中黃酮類化合物網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，丙型肝炎（S22）、乙型肝炎（S25）也是甘草黃酮化合物發(fā)揮作用的主要信號(hào)通路，甘草的抗病毒性肝炎作用可能是以甘草酸為代表的皂苷類與黃酮類化合物協(xié)同作用的結(jié)果。

本研究結(jié)果還顯示，多巴胺能神經(jīng)突觸是甘草中黃酮類化合物發(fā)揮作用的主要信號(hào)通路之一，當(dāng)多巴胺神經(jīng)元系統(tǒng)發(fā)生障礙而導(dǎo)致多巴胺含量減少時(shí)，便出現(xiàn)肌肉緊張和振顫，即帕金森癥。因此，甘草中黃酮類化合物有可能通過多巴胺能神經(jīng)突觸調(diào)節(jié)多巴胺的分泌，從而起到抗帕金森癥作用。本研究結(jié)果還顯示，甘草中黃酮類化合物對(duì)甲狀腺激素分泌有調(diào)節(jié)作用。以上預(yù)測(cè)得到的藥理作用，需進(jìn)一步通過細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，近年來，隨著甘草中黃酮類化合物藥理作用研究的不斷深入，甘草資源將得到更加充分的利用，但其單體化合物的藥理作用研究涉及面較窄且不夠深入，作用機(jī)制也有待進(jìn)一步探究。為了加大對(duì)甘草資源的進(jìn)一步開發(fā)利用，一方面應(yīng)加速黃酮類單體化合物的高效分離和結(jié)構(gòu)解析，另一方面可利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等現(xiàn)代研究手段，不斷挖掘其潛在的構(gòu)效關(guān)系，從而更加精準(zhǔn)、合理、有效地分離出具有新功效的新型黃酮類化合物。相信，隨著甘草中黃酮類化合物功能作用的不斷明確，潛在的藥用價(jià)值以及應(yīng)用領(lǐng)域不斷被開發(fā)出來，其作為新藥或新產(chǎn)品的研發(fā)，必將具有廣闊的前景。