p38絲裂原活化蛋白激酶對人乳牙牙髓干細胞成骨分化能力的影響*

趙振宇 李 影 王 港 朱子鵬 顧 斌

脫落乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)是早期外胚葉間充質組織頭部的神經嵴細胞遷移衍生出的牙髓間充質干細胞，屬于牙源性干細胞，具有良好的生物學性能，包括較高的增殖能力、自我更新能力、廣泛的多向分化能力、且具有一定的免疫調節能力[1,2]。與恒牙牙髓干細胞(dental pulp stemcells，DPSC)相比，SHED具有增殖快、良好而確定的多向分化潛能和取材方便等特性，已經成為口腔組織工程學和再生醫學研究中理想的種子細胞[3]。乳牙與恒牙在來源和成牙特性上相近，然而，在結構和組織學上有一定差異，在干細胞功能上同樣存在一定差異，但具體機制不清。p38-MAPK信號通路在轉導細胞外信號通路中發揮重要作用，是MAPK家族控制炎癥反應及成骨分化的重要分子，它可因炎癥刺激內霉素和滲透壓而激活，從而調控干細胞的遷移、分化和凋亡[4,5]。本研究獲取了人SHED及DPSC，將二者的生物學行為進行了系統比較，我們的研究發現SHED的增殖活性劑及成骨分化能力均優于DPSC。隨后我們進一步檢測在成骨誘導條件下p38 MAPK的活化情況，并特異性抑制p38 MAPK檢測其在干細胞成骨分化過程中的作用，明確p38 MAPK在人SHED及DPSC增殖與成骨分化中的作用機制，為二者作為種子細胞的應用提供一定研究基礎。

1.材料方法

1.1 材料 胎牛血清，DMEM培養基；0.25%胰蛋白酶(Sigma，St Louis，MO，USA)；青鏈霉素(Gibco BRL)；鏈霉素(Gibco BRL)；SB-203580(Selleck，美國)；IL-1β、TNF-α Elisa 試劑盒(上海通蔚生)；ALP染色試劑盒(上海碧云天)實時定量PCR儀IQ5(美國)；RNA抽提試劑盒及逆轉錄試劑盒Fermentas(美國)；Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物上海生物工程公司(中國)；Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒Takara(日本)。Western及IP裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)；p38，p-p38 抗體 (Cell signaling，美國)；OCN抗體ALP抗體(Abcam，美國)；β-Actin，羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。

1.2 樣本收集 于解放軍總醫院第一醫學中心口腔門診收集6歲兒童正常乳恒牙替換期自然脫落乳牙樣本。樣本數量為8例，其中女童5例，男童3例，脫落乳牙無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周炎，牙根吸收達牙根1/2-2/3，且所有納入個體無系統疾病。DPSC取材于18～20歲青年因正畸治療拔除的前磨牙或因埋伏阻生而拔除的第三磨牙樣本，樣本數量為8例，其中男性4例，女性4例。所取得恒牙均無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周病變，且所有納入個體無系統疾病。本研究經醫院倫理委員會批準，在患者知情同意的前提下進行。

1.3 SHED和DPSC的原代培養和分離 消毒即將拔除的乳、恒牙牙體周圍組織，拔牙，立即置4℃預冷的含雙抗DMEM培養液培養瓶內進行原代培養。在超凈臺中，用含青、鏈霉素的0.1mL/L PBS液反復沖洗離體牙，無菌條件下仔細取出乳牙及恒牙牙髓組織，0.1mL/L PBS反復漂洗，剪碎至約1mm×1mm×1mm大小的組織塊。用4%Ⅰ型膠原酶的培養液消化30min，過70μm細胞篩網，組織塊和上清分別采用組織塊法和酶消化法培養細胞。前者25mL培養瓶組織塊貼瓶，2～4h翻瓶；后者1000r/min離心5min，棄上清，加入含15%FBS的DMEM培養液接種于35 mm培養皿，每3d換液，細胞達到約80%匯合時，胰酶消化傳代。采用有限稀釋法克隆化培養分離人乳牙牙髓干細胞及恒牙牙髓干細胞[6,7]，逐步擴增，以P3代用于細胞實驗。

1.4 酶聯免疫吸附試驗檢測 將第三代DPSCs及SHED以1×105的密度接種到24孔板中，每組設3個復孔。待細胞貼壁后，棄原培養液，PBS沖洗3遍，每孔加入1mL含10%FBS的DMEM培養基，72h后收集各孔內的培養液，離心后取上清液進行ELISA檢測。建立標準曲線，按照IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒(上海通蔚生)說明每孔加入待測樣品100μl，洗板，隨后加入一抗工作液50μl，混勻，37℃恒溫孵育60min，洗板，加入酶標抗體工作液100μl反應板充分混勻后置于37℃60min，洗板后加入底物液100μl，置于37℃避光反應10min，最后每孔加入50μl終止液混勻，在450nm處測吸光值。

1.5 成骨誘導試驗 將第三代SHED與DPSC以5×104個/mL的密度接種于6孔板中，用10%FBS的DMEM培養至細胞70%匯合后換成骨誘導液(含 5mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/mL維生素C，1×10-8mol/L地塞米松、10%FBS的DMEM培養液)連續培養，每隔3d換液一次，根據不同實驗內容進行觀察培養。

1.6 堿性磷酸酶染色 SHED和DPSC成骨誘導7d后，棄原培養液，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書配制染液，將細胞用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定液，固定30min。PBS洗3次，加ALP染液37℃孵育60min。蒸餾水輕輕沖洗，洗去染液，照相。顯微鏡下觀察染色結果，藍色為陽性。

1.7 實時定量PCR檢測 將SHED和DPSC常規培養及成骨誘導液7d后用Trizol裂解并提取總RNA，測定RNA濃度，分別反轉錄為cDNA。逆轉錄所得cDNA利用Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒進行熒光定量PCR檢測，反應體系均為 20μl。引物序列：IL-1β forward：5'-CCGT GCCTACGAACATGTC-3'，reverse 5'-CACA CAGAAGCTCATCGGAG-3'；TNF-α forward：5'-AACTCGAGTGACAAGCCCGTAG-3'，reverse 5'-GTACCAGTTGGTTGTCTTTGA-3'；PCNA forward：5'-GGCCGAAGATAACGCGGA TAC-3'，reverse 5'-GGCATATACGTGCAAA TTCACCA-3'；CCND1 forward：5'-ATGTTC GTGGCCTCTAAGATGA-3'，reverse 5'-CAGG TTCCACTTGAGCTTGTTC-3'；Runx2forward：5'-CCCGTGGCCTTCAAGGT-3'，reverse5'-C GTTACCCGCCATGACAGTA-3'；OCNforward：5'-CCCAGGCGCTACCTGTATCAA-3'，reverse 5'-GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3'；β-Actin forward：5'-TGGCACCCAGCACAATG AA-3'，reverse 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCT AGAAGCA-3'。反應條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個循環。IQ5型實時熒光定量PCR儀監測記錄數據，結果根據標準曲線由軟件自動計算后得出。驗證該方法的重復性和擴增效率。本實驗進行三次重復。

1.8 Western blot檢測細胞中的蛋白表達 采用細胞裂解液試劑盒分別提取常規培養條件、成骨誘導7d、SB-203580抑制后各組SHED與DPSC的總蛋白，測定蛋白樣本濃度，制備蛋白樣品。配置10%的分離膠、6%的濃縮膠和1×SDS電泳液，依據蛋白定量結果進行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min待溴酚藍進入分離膠后調整電壓至120V，電泳60min。隨后將凝膠中的蛋白在轉移電泳槽(200mA，2h)中轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluorid，PVDF)膜。用TBST配制的含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液對PVDF膜封閉2h，PVDF膜封閉一抗 p38(1∶800)、p-p38(1∶800)、ALP(1∶1000)、OCN(1∶1000)、β-Actin 為內參，4℃12h。復溫1h后洗膜3次，每次5min。按說明書加入相應濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST洗脫二抗，每次10min，共計3次。漂洗膜后加入電化學發光底物發光顯色試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統照相觀察。

1.9 細胞周期檢測 將實驗組及對照組SHED和DPSC細胞消化后PBS洗兩次，制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/mL，PBS重懸細胞，后加入預冷的70%乙醇1.5mL吹打混勻，4℃過夜，離心棄乙醇，0.01M PBS洗2遍，加入5mol/L的碘化丙錠1mL，4℃避光染色30min，流式細胞儀(BD FACS Callibur，BD，USA)測定DNA含量，根據細胞不同的DNA含量判定細胞周期。

1.10 統計學分析 SPSS17.0統計軟件進行相關數據分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；P＜0.05差異有顯著性。進行多組間比較時，P值進行Bonferroni校正。

2.結果

2.1 SHED和DPSC IL-1β、TNF-α分泌量及基因表達水平檢測 采用Elisa方法檢測SHED及DPSC IL-1β、TNF-α分泌量。結果顯示SHED IL-1β含量為98.7pg/106細胞顯著高于DPSC組(62.5pg/106細胞)(P＜0.05，圖1A)。與之趨勢一致的是SHED TNF-α含量為70.4pg/106細胞顯著高于DPSC組(113.2pg/106細胞)(P＜0.05，圖1A)。實時定量PCR對IL-1β、TNF-α在兩組細胞中表達的檢測結果與Elisa結果一致，SHED IL-1β、TNF-α分泌量顯著高于 DPSC，其中SHED IL-1β表達量是DPSC的3.4倍、TNFα的表達水平是DPSCs的4.6倍(P＜0.05，圖1B)。

圖1 常規培養3d，SHED和DPSC細胞因子的分泌及mRNA檢測

2.2 SHED和DPSC增殖及成骨分化能力檢測第三代細胞進行常規培養72h后收集cDNA進行干細胞增殖能力的檢測。結果顯示，SHED中PCNA及CCND-1的表達水平顯著高于DPSC(圖2A)，將SHED和DPSC成骨誘導7d后進行ALP染色，結果可見藍紫色著色部位，深淺程度并不均一(圖2B)。采用實時定量PCR進行了成骨關鍵基因。結果顯示：SHED和DPSC成骨誘導7d后Runx2表達水平較各自對照組均顯著增高，且成骨誘導后SHED Runx2表達水平顯著高于DPSC(P＜0.05)(圖2C)。另一成骨關鍵基因OCN的表達情況與Runx2趨勢一致，結果顯示成骨誘導7d后OCN在SHED中的表達水平顯著高于DPSC成骨誘導組(P＜0.05＝(圖 2D)。

2.3 p38在SHED和DPSC成骨分化過程中的表達 將SHED和DPSC成骨誘導7d后提取了各自對照組及成骨誘導組的全細胞蛋白，WesternBlot檢測p38及功能化的p-p38在細胞中的表達。結果顯示p38在SHED和DPSC常規培養及成骨誘導條件下均表達，成骨誘導后p38的含量略降低。而p-p38在DPSC對照組并不表達，成骨誘導后表達量增高。p-p38在SHED成骨誘導前后均表達成骨誘導7d后其表達量增高(圖3)。

圖2 SHED和DPSC增殖與成骨分化潛能檢測

圖3 SHED和DPSC成骨誘導7d后Western Blot檢測p-p38及p38蛋白檢測，以β-Actin作為內參

2.4 抑制p38 MAPK對SHED和DPSC增殖及成骨分化能力的影響 加入10μmol/L特異性p38 MAPK抑制劑SB203580 60min[8]后收集SHED和DPSC全細胞蛋白Western Blot結果顯示SB203580可顯著抑制功能化的p-p38(圖4)。在SB203580抑制SHED和DPSC 60min后P更換為常規培養液，繼續培養4d后檢測細胞周期。結果顯示SHED對照組G1G0期細胞比例為34.57%，G2M期為7.23%，S期為58.2%；SHED SB203580干預組G1G0期細胞比例為75.7%，G2M期為0.08%，S期為24.22%；DPSC對照組G1G0期細胞比例為45.9%，G2M期為0.89%，S期為53.22%；DPSC SB203580干預組G1G0期細胞比例為85.24%，G2M期為2.0%，S期為12.76%(圖5A)。隨后采用Western Blot檢測在SB203580抑制SHED和DPSC60min后成骨誘導7d后，結果顯示抑制p38 MAPK可抑制SHED和DPSC OCN及ALP的表達(圖 5B)。

圖4 p38 MAPK抑制劑SB203580干擾60min后兩種細胞p38MAPK表達

圖5 A：SB203580干擾SHED和DPSC后流式細胞儀檢測細胞周期

3.討論

乳牙牙髓干細胞起源于神經嵴，存在于牙髓血管周圍，在兒童及青少年脫落的乳牙中含有豐富的SHED，最近的研究表明：SHED具有多向分化潛能，可治療包括系統性紅斑狼瘡缺血性腦損傷脊髓損傷和肌萎縮等動物模型的疾病，相比其他干細胞具有更強的自我更新性能，表現為克隆形成多、生長穩定、增殖快速等特點[9-12]。除了組織再生潛能外，SHED還具有優越的免疫調節性能。SHED的臨床應用前景非常廣泛，但其具體的成骨作用機制仍不明確。鑒于此本研究選擇青年患者的DPSC作為對照細胞，將其生物學性能與SHED進行相應對比。

我們的研究結果顯示SHED的IL-1β、TNF-α分泌量及基因表達水平均顯著高于DPSC，這與Silva Fde S13的研究結果一致。IL-1β、TNF-α在SHED中有較高的分泌量及基因表達量這提示SHED與免疫調節密切相關，其免疫學性能及干細胞分化性能均優于牙髓間充質干細胞。在干細胞功能方面本研究進行了干細胞的增殖潛能及成骨分化潛能兩個方面的檢測。優良的種子細胞需具備較好的干細胞自我更新能力，干細胞的增殖是自我更新的一個重要指標。因此我們檢測了細胞增殖中的關鍵基因PCNA及CCND-1二者均是檢測細胞周期的重要指標，我們的研究結果顯示SHED較DPSC有更優異的細胞增殖能力。隨后我們采用ALP染色及實時定量PCR技術檢測了其成骨分化能力。結果表明其成骨分化能力同樣優于DPSC。這與前期的研究報道結果一致[3]，上述結果表明SHED具備優異的干細胞性能。在干細胞的成骨分化過程中多種分子信號通路同時發揮調控作用，明確其成骨分化的機理更有益于SHED作為種子細胞的臨床應用。

MAPK是一組可以被多種細胞外信號激活的蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶，處于胞漿信號轉導通路的終末位置，主要參與生長因子、激素、細胞因子、應激等多種刺激下的細胞反應以及細胞的生長分化。目前，MAPK家族有五大類成員，分別為細胞外信號調節激酶(Extracellular-signal regulated protein kinase，ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應激激活蛋白激酶(Stress-activated protein kinase，SAPK)、p38 MAPK、ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)和ERK3/4等[14]。其信號傳導途徑在間充質干細胞向成骨細胞的增殖分化中有著重要的作用。p38MAPK的特異性抑制劑SB203580屬于腑睫異咪咕哇化合物。SB203580并不阻斷上游激酶對p38MAPK的激活，而是作用于p38MAPK本身。SB203580是一種可透過細胞膜的p38MAPK特異性抑制劑，其通過與ATP競爭性結合p38MAPK激酶的核酸結合位點而抑制p38MAPK激酶對其底物的磷酸化[8]。我們的研究表明SHED中p38MAPK的表達水平顯著高于DPSC，這可能是由于SHED中分泌及表達的炎癥因子升高所致。前期有研究表明p38MAPK與干細胞的炎癥狀態密切相關，一定劑量的LPS或者INF-γ均可激活細胞內的p38MAPK[15,16]。而另一方面p38MAPK又參與細胞的成骨分化這也是SHED成骨分化能力增強的一個關鍵原因。本研究驗證了SB203580可高效的抑制p38MAPK。在p38MAPK信號被阻斷后，流式細胞儀檢測的細胞周期結果表明無論SHED還是DPSC其增殖指數都相應下降，這提示干細胞的增殖能力受到一定的抑制。與此同時我們觀察到OCN及ALP的表達水平均下調。從干細胞增殖及成骨分化兩方面的結果來看p38MAPK可使間充質干細胞的生物學性能降低，尤其對SHED的成骨分化能力有很大影響。

SHED具有廣泛便捷的組織來源及優秀的干細胞生物學性能，使其成為口腔頜面部骨組織再生中極具應用前景的干細胞源。更值得關注的是：2015年7月，我國首家GMP級乳牙干細胞庫在世界口腔干細胞之父施松濤教授努力下落戶北京，這為SHED應用提供了基礎并拓寬的應用空間。本研究以SHED作為種子細胞研究MAPK信號通路在其成骨分化過程中的作用，為SHED的臨床應用提供了一定的研究基礎。