丹皮酚對(duì)老年人牙周狀況的影響研究

王紅梅 蔡興偉 徐 邁 何 鑫 郝作琦

口腔是人體消化道的入口，既有消化功能，又存在大量微生物，因此口腔健康對(duì)人體健康起著至關(guān)重要的作用，而口腔維護(hù)是清潔口腔、預(yù)防口腔及全身疾病的重要手段[1]。牙周病是局部慢性感染性口腔疾病，以厭氧菌感染為主，牙周袋內(nèi)的細(xì)菌、微生物及其產(chǎn)物擴(kuò)散至附近或遠(yuǎn)隔器官，從而導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)，造成牙周組織破壞[2,3]，老年人由于身體機(jī)能退化，這一過程更為迅速。在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中，MMPs中的MMP-3可以剪切、活化其它類型MMPs，并引起牙槽骨吸收和改建[4,5]。有研究顯示丹皮酚(Paeonol，Pae)具有鎮(zhèn)靜、解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化等藥理特性[6,7]，推測(cè)丹皮酚對(duì)牙周組織同樣具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的功效。因此，根據(jù)老年人的生理、心理和社會(huì)特點(diǎn)，本研究通過觀察使用丹皮酚水提取物對(duì)老年人進(jìn)行口腔維護(hù)前后GCF總量、GCF中MMP-3水平的變化以及5種牙周致病菌的檢出率，探討丹皮酚對(duì)老年人牙周組織炎癥的影響，為選擇簡(jiǎn)便合理的臨床口腔維護(hù)方式提供參考。

1.材料與方法

1.1 病例納入及分組 選擇2015年6月～2017年6月在火箭軍特色醫(yī)療中心口腔科進(jìn)行口腔常規(guī)體檢的老年患者(≥60歲)120例，男性68例，女性52例，年齡(60.2±4.5)歲，以隨機(jī)數(shù)法平均分為A、B、C三組：A組患者使用丹皮酚水提取物(500mmol/L含漱，不低于1min)漱口；B組患者使用醫(yī)用棉簽蘸取雙氧水(3%)擦拭牙齦組織，每象限擦拭時(shí)間1min；C組患者使用生理鹽水含漱1min。各組患者每天按分組狀況維護(hù)6次并進(jìn)行常規(guī)口腔維護(hù)(早中晚三次刷牙，Bass刷牙法)。納入條件：無未充填的齲壞，無中、重度慢性成人牙周炎且無全身系統(tǒng)性疾病，口內(nèi)余留牙不少于20顆，口內(nèi)檢測(cè)AL＜3mm[8]；研究開始一周前進(jìn)行牙周潔治；3個(gè)月內(nèi)未使用抗生素以及免疫抑制劑。三組患者一般資料(年齡、性別、職業(yè)、婚姻、學(xué)歷、基礎(chǔ)疾病史等)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。所有患者均知情同意。

1.2 材料 標(biāo)準(zhǔn)菌株(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔內(nèi)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó))；丹皮酚(中國(guó)藥品生物制品檢定所，中國(guó))，酶聯(lián)檢測(cè)儀(南京華東電子，中國(guó))；ELISA試劑盒(廣州欣盛生物工程有限公司，中國(guó))；Whatman專用濾紙(Whatman公司，英國(guó))。

1.3 口腔檢查 受試者的口腔檢測(cè)由同一位高級(jí)職稱醫(yī)師完成。使用Williams牙周探針檢測(cè)全口余留牙齒6個(gè)位點(diǎn)(頰面近中，中部，遠(yuǎn)中；舌面近中，中部，遠(yuǎn)中)。記錄探診深度(probing depth，PD)以及附著喪失程度(attachment loss，AL)，取平均值并且記錄菌斑指數(shù)(plaque index，PLI)以及缺牙數(shù)及牙齒松動(dòng)度。

1.4 采集樣本 將Whatman濾紙裁成8mm×3mm大小，消毒、烘干并稱重。吹干檢測(cè)區(qū)域、隔濕，將濾紙插入待測(cè)患牙頰側(cè)中部齦溝內(nèi)，1min后取出并再次稱重，復(fù)檢三次取平均值，前后質(zhì)量差為GCF量。濾紙使用2%PBS液離心(10000r/min，10min)后提取上清液，于低溫冰箱-70℃保存待檢。患者每周進(jìn)行電話隨訪，并于1個(gè)月和3個(gè)月后復(fù)查，采集齦溝液樣本。

1.5 測(cè)定MMP-3含量 解凍樣本，稀釋后加入生物素標(biāo)記的抗體，振蕩混勻37℃溫育1h，洗滌后吸干并重復(fù)3次；加入親和鏈酶素-HRP混勻，37℃溫育30分鐘后吸干，重復(fù)3次加入底物振蕩混勻，37℃溫育10min，加入終止液并立即測(cè)定MMP-3含量(MMP含量=MMP總量/GCF量；MMP總量=MMP檢測(cè)量×洗脫體積)。

1.6 牙周致病菌的檢測(cè) 維護(hù)前后，分別將各組患者檢測(cè)區(qū)域吹干并用無菌棉球嚴(yán)格隔濕后，去除齦上菌斑和牙結(jié)石，采用4-site法(患者口內(nèi)按象限分為四個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)牙周探診最深點(diǎn)作為取樣點(diǎn))使用無菌刮匙刮取齦袋底的齦下菌斑，在待測(cè)牙頰側(cè)中部取樣點(diǎn)插入標(biāo)準(zhǔn)滅菌紙尖至牙周袋底，靜置10s后取出紙尖裝入含有厭氧轉(zhuǎn)送液的離心管，加入2%PBS液高速離心(12000r/min，10min)后提取沉淀DNA。自行設(shè)計(jì)、合成引物(表1)，對(duì)齦下菌斑DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以5種標(biāo)準(zhǔn)菌株：伴放線放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,A.a)(ATCC 29523)、牙齦卟啉單孢菌(Porphyromonas gingivdis,P.g)(ATCC33277)、中間普氏菌(Prevotella intermedia,P.i)(ATCC 25611)、福賽氏類桿菌(Tannerella forsythia,T.f)(ATCC 43037)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola,T.d)(ATCC 43037)為陽性對(duì)照，以變異鏈球菌(ATCC 27607)為陰性對(duì)照。

表1 5種牙周致病菌特異性引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，本實(shí)驗(yàn)為測(cè)量時(shí)間間隔不等重復(fù)資料，采用不等距重復(fù)測(cè)量的方差設(shè)計(jì)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

最終完成維護(hù)的患者共120人，使用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，組間和組內(nèi)比較分別使用LSD檢驗(yàn)和Bonferroni檢驗(yàn)。

2.1 牙周指標(biāo)比較 組內(nèi)比較時(shí)，A、B兩組維護(hù)后PD、PLI指數(shù)在1個(gè)月、3個(gè)月與維護(hù)前相比均有顯著性差異(P＜0.05)；AL指數(shù)僅在3個(gè)月時(shí)與維護(hù)前相比均有顯著性差異(P＜0.05)；C組維護(hù)前后相比無顯著性差異(P＞0.05)。組間比較時(shí)，A、B兩組PD、PLI指數(shù)與C組在維護(hù)后的不同時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異(P＜0.05)；而僅在3個(gè)月時(shí)A、B兩組AL指數(shù)與C組比較有顯著性差異(P＜ 0.05)(表 2～表 4)。

2.2 GCF量、MMP-3含量比較、組內(nèi)比較時(shí)，A、B兩組維護(hù)后GCF量、MMP-3水平在1、3個(gè)月與維護(hù)前相比均有顯著性差異(P＜0.05)，C組維護(hù)前后相比無顯著性差異(P＞0.05)。組間比較時(shí)，A、B兩組與C組在維護(hù)后的不同時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異(P＜0.05)，而僅在3個(gè)月時(shí)A、B兩組GCF量、MMP-3水平比較有顯著性差異(P＜ 0.05)(表 5，表 6)。

2.3 5種牙周致病菌的檢出情況比較 A、B組致病菌的檢出率與維護(hù)前比較具有顯著性差異(P＜0.05)，C組牙齦卟啉單孢菌、中間普氏菌和福賽氏類桿菌與維護(hù)前比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，齒垢密螺旋體和伴放線放線桿菌的檢出率與維護(hù)前比較具有顯著性差異(P＜0.05)；B組和C組牙周致病菌檢出率高于A組(P＜0.05)；C組牙周致病菌檢出率高于B組(P＜0.05)(表7)。

表2 牙周指數(shù)PD維護(hù)前、后的分組比較(x±s)

表3 牙周指數(shù)AL維維護(hù)前、后的分組比較(x±s)

表4 牙周指數(shù)PLI維護(hù)前、后的分組比較(x±s)

表5 GCF量維護(hù)前、后的分組比較(x±s)

表6 MMP-3含量維護(hù)前、后的分組比較(x±s)

表7 5種牙周致病菌的檢出情況比較(N/%)

3.討論

大部分老年患者缺乏口腔維護(hù)健康知識(shí)，進(jìn)行口腔維護(hù)時(shí)，應(yīng)該從患者生理、心理、社會(huì)的特點(diǎn)出發(fā)，做好不同年齡、職業(yè)以及經(jīng)濟(jì)收入的人群的口腔維護(hù)教育工作，耐心聽取患者的意見，緩解患者的緊張情緒，使其接受維護(hù)和治療[9]。在維護(hù)前，要了解老年患者口腔大體情況，并且在與患者積極溝通的情況下，征得本人同意進(jìn)行維護(hù)和治療，維護(hù)過程中需要加強(qiáng)與患者的交流與溝通，患者的配合對(duì)于治療和維護(hù)有著非常重要的意義。

丹皮酚(C9H10O3)是芍藥科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的根皮中主要的藥物活性成分，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常、促進(jìn)微循環(huán)、保護(hù)缺血組織、抗腫瘤、抗菌等多種藥理作用[10]。目前尚無Pae對(duì)牙周組織炎癥的報(bào)道。GCF是牙齦組織分泌的一種體液，主要來源于齦溝上皮和結(jié)締組織的破壞產(chǎn)物；牙周組織產(chǎn)生的間質(zhì)液；血漿以及齦下微生物的產(chǎn)物，可以用來反映牙周組織的健康情況。MMP-3是一種含有二價(jià)鋅離子酶活性中心的蛋白水解酶的基質(zhì)溶解素，MMP-3可以剪切、活化并誘導(dǎo)其它類型MMPs表達(dá)[11]，以引起牙槽骨的吸收和改建。MMP-3還可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，在組織破壞與重建中起重要作用[12]。MMP-3主要由破骨細(xì)胞、破牙骨質(zhì)細(xì)胞以及牙周膜成纖維細(xì)胞分泌，可以反映牙周炎癥的程度[13]。因此，MMP-3水平可作為反映牙周組織的破壞和炎癥水平，是評(píng)價(jià)牙周組織臨床及維護(hù)療效的客觀指標(biāo)之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A、B兩組維護(hù)后牙周指數(shù)出現(xiàn)不同程度的下降，GCF量、MMP-3水平有顯著性下降(P＜0.05)，C組無明顯差異(P＞0.05)。維護(hù)后的同一時(shí)間點(diǎn)A、B兩組與C組有顯著性差異(P＜0.05)，而在3個(gè)月時(shí)A、B兩組GCF量、MMP-3水平比較有顯著性差異(P＜0.05)。說明丹皮酚漱口和雙氧水擦拭的維護(hù)方式可以減少牙周組織進(jìn)一步損傷，使炎性細(xì)胞因子分泌下降，并改變中性粒細(xì)胞的趨化功能，使炎癥介質(zhì)分泌減少，牙周組織炎癥得以恢復(fù)。相同的環(huán)境下丹皮酚漱口比雙氧水擦拭的維護(hù)方式要更優(yōu)越，這可能是因?yàn)榈てし痈鼜?qiáng)力的抗炎和調(diào)節(jié)免疫效果，具體機(jī)制需要通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)菌感染是始動(dòng)因素。本研究選取5種公認(rèn)的牙周可疑致病菌，其中P.g是重要的牙周致病菌之一，牙周炎癥越重，齦下菌斑中P.g的檢出率越高，P.g、T.f和T.d三者又稱“紅色復(fù)合體”，具有顯著的毒力和致病性，能干擾宿主的防御機(jī)制以破壞牙周組織。本研究采用PCR法進(jìn)行厭氧菌檢測(cè)。結(jié)果表明丹皮酚與雙氧水都有一定的抑菌作用(P＜0.05)，而生理鹽水不具備這樣的作用(P＞0.05)，丹皮酚與雙氧水比較時(shí)顯示丹皮酚可以顯著降低老年人牙周可疑致病菌的檢出率(P＜0.05)。

本研究通過觀察三種不同的口腔維護(hù)方式對(duì)老年人GCF、MMP-3水平變化的影響以及牙周致病菌的檢出率，說明丹皮酚漱口和雙氧水擦拭的維護(hù)方式比生理鹽水漱口的維護(hù)方式預(yù)后效果更好，而丹皮酚漱口的維護(hù)方式效果更為優(yōu)越，為臨床牙周炎的維護(hù)選擇提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)3種維護(hù)方式對(duì)于牙周指數(shù)指標(biāo)、GCF以及MMP-3水平的長(zhǎng)期影響以及對(duì)于口腔正常菌群的影響還需要進(jìn)一步跟蹤研究。