2型糖尿病患者牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究*

劉長營 馬攀 耿 威 林瀟 李 鈞

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種糖代謝異常及全身新陳代謝異常并具有遺傳傾向的慢性疾病。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)估計(jì)，2013年患有糖尿病的成年人有3.8億，到2035年，預(yù)計(jì)增加到5.9億[1]。目前，我國糖尿病患病率為9.7%，患者人數(shù)近1個(gè)億，并呈快速增長趨勢[2]，已成為糖尿病第一大國。糖尿病分為1型和2型，有90%的糖尿病患者為2型糖尿病。糖尿病患者常伴有骨代謝及鈣、磷代謝的障礙，引起繼發(fā)性骨量減少及骨質(zhì)疏松等DM性骨病[3]。臨床上要求種植修復(fù)的2型DM患者也日益增多。但2型DM一直被認(rèn)為是種植手術(shù)的相對禁忌癥。糖尿病病人的異常高血糖狀態(tài)所引起的一系列病理變化，導(dǎo)致骨結(jié)合差，是糖尿病病人種植義齒失敗的重要原因。但2型糖尿病影響骨結(jié)合的具體機(jī)制尚不清楚。

骨結(jié)合是一個(gè)動態(tài)的骨改建過程，成骨細(xì)胞在此過程中起著非常重要的作用。而成骨細(xì)胞多起源于多潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)。BMSCs具有多向分化潛能和自我更新能力，是骨組織再生的重要種子細(xì)胞，成骨發(fā)生的關(guān)鍵是BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，這可能也是形成種植體骨結(jié)合的關(guān)鍵。種植體與骨組織間的結(jié)合是一種動態(tài)的骨改建與吸收的過程，種植體植入后早期，在手術(shù)區(qū)血凝塊形成后，會有類似輕度的炎癥反應(yīng)出現(xiàn)，包括大量的吞噬細(xì)胞和從鄰近骨膜組織來的未分化的BMSCs的增殖與分化，從周圍骨膜新分化的成骨細(xì)胞能夠分泌產(chǎn)生編織樣的骨基質(zhì)最早與氧化表面形成接觸。因此，在骨損傷修復(fù)的過程中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在損傷部位募集起著至關(guān)重要的作用[4,5]。DM是如何通過內(nèi)環(huán)境影響B(tài)MSCs的生物學(xué)特性和功能，從而影響骨結(jié)合，機(jī)制目前尚不清楚。本研究以糖尿病患者BMSCs為研究模型，在體外模擬正常糖濃度和高血糖狀態(tài)，觀察糖尿病患者BMSCs生物學(xué)特性，為進(jìn)一步探討糖尿病影響種植體骨結(jié)合的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 人牙槽骨BMSCs取自在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院種植中心行種植手術(shù)的病人，所收集的種植窩制備過程中產(chǎn)生的骨碎屑均向患者說明，征得患者知情同意并簽署知情同意書。

正常人入組標(biāo)準(zhǔn)：全身狀況良好，無系統(tǒng)性疾病，無傳染性疾病，無吸煙、飲酒等不良嗜好。

2型糖尿病患者入組標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病病史，確診為2型糖尿病，空腹血糖＞6.2mmol/L，長期服用降血糖藥物，否認(rèn)骨質(zhì)疏松癥，否認(rèn)其他系統(tǒng)病史，無吸煙飲酒等不良嗜好。

以上兩組牙列缺損患者入組時(shí)均進(jìn)行年齡匹配(見表 1，表 2)。

表1 正常人患者基本情況

表2 糖尿病患者基本情況

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基，含糖量為4.5g/L(Gibco，美國)，DMEM低糖培養(yǎng)基，含糖量為1.0g/L(Gibco，美國),胎牛血清，青-鏈霉素，磷酸鹽緩沖液，胰蛋白酶(Gibco，美國)；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，中國)；Trizol Reagent(Life Technologies，美國)，無水乙醇(國藥化學(xué)試劑，中國)，氯仿(國藥化學(xué)試劑，中國)。

1.2 方法

1.2.1 人牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲取、分離與培養(yǎng)與表面標(biāo)記物鑒定 于種植手術(shù)中收集各級擴(kuò)孔鉆凹槽以及種植窩中的骨屑，在無菌操作下放入15ml離心管(5mlPBS+1%青-鏈霉素)內(nèi),1100r/min離心6min，棄上清液，加入5mlDMEM培養(yǎng)基(15%胎牛血清，2 mmoL/L谷氨酰胺，100U／ml青霉素，100ug／ml鏈霉素)，重懸后移入6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)到第6天，對細(xì)胞進(jìn)行全換液，PBS清洗，盡量去凈培養(yǎng)瓶內(nèi)骨屑。接下來每2～3天對細(xì)胞更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞長至接近80%～90%融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶按1∶2消化、傳代。

流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)記物：取第5代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶含(EDTA)消化離心。PBS清洗一次，將細(xì)胞再以5×106/ml細(xì)胞濃度重懸于PBS中。取流式管，各取100μl細(xì)胞懸液，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD45-FITC，CD90-FITC，HLA-DR-FITC，CD34-PE，CD44-PE，CD73-PE，CD105-PE，以及同型對照抗體Mouse IgG1-FITC，MOUSE IgG1-PE各20μl，4℃避光下孵育30min。1000r/min離心5min，PBS洗一次。棄去上清液，加入100μl PBS混勻，4℃避光保存。4h內(nèi)流式細(xì)胞儀上樣，檢測相關(guān)分子的表達(dá)情況。

在本研究中，應(yīng)用的正常人BMSCs和糖尿病患者BMSCs為4～5代，在同一實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用的BMSCs為同一代數(shù)。正常人和糖尿病患者BMSCs消化、傳代后各分為兩組，分別加入高糖培養(yǎng)基和低糖培養(yǎng)基。共四組細(xì)胞：正常人高糖組、低糖組；糖尿病高糖組、低糖組。

1.2.2 CFSE摻入及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 每組細(xì)胞消化后，以0.1%BSA重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml；加入2μl 5 mM CFSE，使CFSE終濃度為10μM；37℃孵育10min，冰上孵育5min；1500rpm離心10min，去上清，以DMEM培養(yǎng)基洗3次后，放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)；3d后，消化細(xì)胞，1500rpm離心10min，500μl 0.1%BSA重懸；流式細(xì)胞儀檢測(488通道)，使用Modfit軟件分析增殖指數(shù)。

1.2.3 Annexin V/PI及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 每組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度；取1×106重懸的細(xì)胞，1000g離心5min，棄上清，加入350μl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻；室溫(20～25℃)避光孵育10min，可以用鋁箔進(jìn)行避光；隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將細(xì)胞按5×105/ml接種于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中孵育細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，用200ul槍頭垂直于孔板底劃痕，PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每孔隨機(jī)選取5個(gè)不同的區(qū)域，分別于0h，6h，24h取樣，倒置熒光顯微鏡下，應(yīng)用CellSens軟件分析。找到標(biāo)記處，保證每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量均為同一位置，測量細(xì)胞間距離，隨機(jī)測量3次取平均值，拍照。遷移距離為兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量值的差值。

1.2.5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 將純鈦鈦片修整為1*1cm大小，丙酮浸泡、脫脂，無水乙醇反復(fù)沖洗，再用去離子水沖洗，高溫高壓消毒備用；將培養(yǎng)至第4代的BMSCs，取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將預(yù)先消毒好的鈦片鋪入24孔板底部，每孔加入2*104個(gè)細(xì)胞鋪板，每樣本設(shè)3復(fù)孔，共4組；分別于6h，12h后吸出培養(yǎng)液，收集，待行細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入4℃預(yù)冷2.5%戊二醛固定液固定1～2h；10%PB沖洗3次，每次10min，4℃保存；1%鋨酸4℃下固定1h。系列梯度酒精脫水，干燥，噴金。掃描電鏡觀察。觀察時(shí)將鈦片中心置于SEM視野的中央，再向固定方向移動視野，觀察每組BMSCs在鈦片表面的黏附形態(tài)，拍照。

細(xì)胞黏附率的測定：分別收集每組吸出的細(xì)胞懸液，上CountStar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，測定細(xì)胞黏附率，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞黏附率=(20000-培養(yǎng)液中剩余的細(xì)胞數(shù))/20000*100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較采用ANOVA分析,P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察與生長狀況及表面標(biāo)記物鑒定 在BMSCs細(xì)胞原代培養(yǎng)中，正常人BMSCs在第5～6天時(shí)可見細(xì)胞從組織塊中爬出，而2型糖尿病患者BMSCs則在第7～9天時(shí)才有少量爬出。兩者的細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，細(xì)胞形態(tài)梭形或者三角形，隨著細(xì)胞數(shù)量的增多和生長，胞棱較大，核仁呈橢圓形。隨著細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞間交織成網(wǎng)。正常人在第14天，細(xì)胞增殖良好，貼壁良好，成克隆性生長，可見克隆集落形成，集落中心細(xì)胞密集，周圍細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀排列，形態(tài)與成纖維樣細(xì)胞相似，成指紋樣生長，細(xì)胞融合達(dá)到80%，此時(shí)進(jìn)行傳代。而2型糖尿病患者細(xì)胞經(jīng)16～20d培養(yǎng)后，融合達(dá)到底面積80%時(shí)，才能進(jìn)行傳代(見圖1)。

圖1 A：糖尿病患者原代BMSCs(40x)；B：傳代后(P5)糖尿病BMSCs(40x)；C：傳代后(P5)糖尿病BMSCs(100x)；D：正常人原代BMSCs(40x)；E：傳代后(P5)正常人BMSCs(40x)；F：傳代后(P5)正常人 BMSCs(100x)。

傳代后兩者的細(xì)胞形態(tài)稍有不同，正常人種植窩來源的牙槽骨BMSCs隨著細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞間更為密集，均勻，交織成網(wǎng)，細(xì)胞核較大，較為明顯，細(xì)胞的生長速度較快，每2～3d可傳代一次；而糖尿病患者BMSCs的細(xì)胞棱角稍大，細(xì)胞間的密集度稍小，其生長速度較正常人BMSCs的生長速度慢，需4～5d后傳代一次。

細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定：采用第5代細(xì)胞，取樣抗體標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示CD44、CD73、CD90和CD105陽性表達(dá)，而CD34、CD45和HLA-DR陰性表達(dá)。陽性標(biāo)志物表達(dá)均大于95%，陰性標(biāo)志物表達(dá)均小于2%。表達(dá)情況及陽性率符合BMSCs一般特點(diǎn)(見圖2)。

圖2 人牙槽骨BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示CD44、CD73、CD90和CD105陽性表達(dá)，而CD34、CD45和HLA-DR陰性表達(dá)。

2.2 CFSE摻入及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 通過應(yīng)用CFSE摻入法及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病高糖組增殖指數(shù)為17.16±0.437；糖尿病低糖組增殖指數(shù)為25.107±2.478；正常人高糖組增殖指數(shù)為18.587±1.688；正常人低糖組增殖指數(shù)為27.227±1.426；方差分析顯示，四組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低糖組明顯高于高糖組。說明BMSCs細(xì)胞在高糖環(huán)境下的增殖明顯減弱(見圖3)。

2.3 Annexin V/PI及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，四組BMSCs中糖尿病高糖組的細(xì)胞凋亡率最高，約為12.1%，而其他三組的細(xì)胞凋亡率明顯較小，其中正常人低糖組細(xì)胞凋亡最少。糖尿病低糖組細(xì)胞凋亡為4.43%；正常人高糖組細(xì)胞凋亡為3.49%；正常人低糖組細(xì)胞凋亡為2.56%；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。

圖3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：CFSE摻入法及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，在正常人和糖尿病患者組中，低糖組明顯高于高糖組，P＜0.05。

圖4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：四組BMSCs中糖尿病高糖組的細(xì)胞凋亡率最高，約為12.8%，而其他三組的細(xì)胞凋亡率明顯較小，其中正常人低糖組細(xì)胞凋亡最少。

2.4 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 通過細(xì)胞黏附率的檢測發(fā)現(xiàn)，正常人低糖組BMSCs在6小時(shí)的黏附率為88.13%±4.5%，稍高于其他三組，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常人高糖組黏附率為75.54%±13.79%，糖尿病高糖組黏附率為85.07%±7.08%，糖尿病低糖組為82.53%±8.29%。而12小時(shí)的黏附率四組均可達(dá)到87%～91%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，鈦片表面可見到BMSCs附著，細(xì)胞形態(tài)呈梭狀，邊緣有偽足伸出，細(xì)胞多尚未完全展開，偽足伸展不充分，細(xì)胞核體積較大，各組之間形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯差異(見圖5A，B)。

圖5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)：四組細(xì)胞在6h 時(shí)黏附率可達(dá)75%～88%，12h時(shí)粘附率可達(dá)87%～91%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)(3000x)各組之間形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯差異。A：正常人牙槽骨BMSCs；B：糖尿病患者BMSCs。

2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 通過劃痕法進(jìn)行細(xì)胞遷移能力測定，發(fā)現(xiàn)6小時(shí)和24小時(shí)后正常人BMSCs在高糖和低糖環(huán)境下遷移距離均大于糖尿病患者BMSCs的遷移距離，正常人組劃痕兩側(cè)的BMSCs 24h后幾乎融合在一起，而糖尿病患者劃痕兩側(cè)細(xì)胞尚有一定的距離。24h時(shí)正常人低糖組的遷移距離最高，為426.33±72.767μm；正常人高糖組遷移距離次之，為397.33±110.17μm；而糖尿病高糖組和低糖組分別為201.33±92.45μm和224.67±49.21μm，P＜0.05。在 6h時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)正常人BMSCs的遷移距離大于糖尿病BMSCs的遷移距離，正常人組與糖尿病組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖 6)。

圖6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：A：在倒置顯微鏡下測量細(xì)胞間距離，遷移距離為兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量值的差值。B：倒置顯微鏡下觀察(40x)，糖尿病組BMSCs 24h后細(xì)胞遷移情況。C：倒置顯微鏡下觀察(40x)，正常人組BMSCs 24h后細(xì)胞遷移情況。*表示該組細(xì)胞遷移距離與正常人組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.討論

由于直接從患者牙槽骨取材有一定的創(chuàng)傷及風(fēng)險(xiǎn)，所以目前關(guān)于糖尿病患者牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究還比較少，國內(nèi)外許多研究多是采用正常的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外模擬不同的高糖環(huán)境，觀察BMSCs生物學(xué)特性的改變。國外曾有學(xué)者報(bào)道可通過收集種植擴(kuò)孔鉆上骨屑來培養(yǎng)人牙槽骨骨髓基質(zhì)干細(xì)胞[6]。本研究采用同樣的方法從種植手術(shù)過程所收集的骨屑中，可以成功的分離培養(yǎng)出BMSCs，探討出一種不需拔牙或組織活檢等即能獲得口腔頜面部組織工程種子細(xì)胞的方法，能夠?qū)谇活M面部組織工程帶來新的機(jī)遇，同時(shí)很可能是一種創(chuàng)傷最小的口腔頜面部種子細(xì)胞獲取的方法。通過這種方法對糖尿病患者牙槽骨BMSCs進(jìn)行研究將比在體外模擬不同濃度的高糖環(huán)境更直接，更有效，能夠更好的為糖尿病患者牙種植提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

同時(shí)，本研究除了直接從糖尿病患者的種植過程中獲取BMSCs外，還對獲取的BMSCs在體外應(yīng)用不同的糖濃度進(jìn)行刺激，模擬糖尿病患者體內(nèi)高血糖的水平，研究其BMSCs的生物學(xué)特性。本研究選擇的低糖濃度為1g/L，約為5.56mmol/L，近似于正常情況下的血糖水平；選擇的高糖濃度為4.5g/L，約為25mmol/L，與許多文獻(xiàn)報(bào)道的糖濃度接近。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，糖濃度達(dá)到24mmol/L時(shí)對細(xì)胞的增殖、骨基質(zhì)礦化、成骨分化影響較明顯，所以本研究選擇25mmol/L作為高糖組。本研究將正常人和糖尿病患者的BMSCs分別應(yīng)用兩種糖濃度培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)：糖尿病高糖組用來模擬糖尿病患者血糖未控制；糖尿病低糖組用來模擬糖尿病患者血糖控制良好的情況；正常人低糖組用來模擬正常人血糖水平；正常人高糖組用來模擬之前學(xué)者關(guān)于糖尿病BMSCs的研究。以正常人低糖組作為對照，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病高糖組BMSCs的增殖能力和遷移能力明顯下降，而細(xì)胞凋亡明顯增高；而糖尿病低糖組BMSCs僅在遷移能力上表現(xiàn)比對照組差，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡與對照組無明顯區(qū)別；而正常人高糖組僅增殖能力較對照組下降，而凋亡和遷移能力未發(fā)現(xiàn)明顯下降。所以之前有的研究采用正常的BMSCs細(xì)胞在高糖環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)來模擬糖尿病BMSCs，并不能完全反映出糖尿病患者的真實(shí)情況。本研究的分組更全面、更客觀。

本研究通過觀察糖尿病患者以及正常人的BMSCs的增殖、凋亡情況，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者BMSCs在高糖環(huán)境下細(xì)胞的增殖能力明顯低于正常人的BMSCs，同時(shí)也低于在低糖環(huán)境下的增殖能力，而DM高糖組BMSCs的細(xì)胞凋亡率明顯高于其他三組。這提示我們糖尿病患者高糖環(huán)境嚴(yán)重影響了BMSCs的增殖能力，反而容易引起B(yǎng)MSCs的過早凋亡。Sun等[8]通過對2型糖尿病患者牙槽骨成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，也發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者牙槽骨成骨細(xì)胞增殖較緩慢。Dliloglu-Gurhan[9]等發(fā)現(xiàn)糖濃度的增高可以引起骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的過早衰老，使得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的凋亡顯著增加、增殖減少。Gopalakrishnan[10]等也證實(shí)，高糖環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，堿性磷酸酶活性、鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)目等都顯著降低，認(rèn)為高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞分化能力減弱，這可能是糖尿病骨質(zhì)疏松的原因之一。這與本研究的結(jié)果類似。

種植體骨結(jié)合是種植成功的關(guān)鍵，成骨細(xì)胞在種植材料表面的附著、黏附和伸展是細(xì)胞和材料作用的第一期，對于細(xì)胞后期的增殖和分化進(jìn)而形成良好的骨結(jié)合界面至關(guān)重要。由于細(xì)胞黏附后才發(fā)生遷移、增殖、分化并分泌鈣基質(zhì)，細(xì)胞在材料表面的黏附直接影響到后繼的生物學(xué)行為，是接觸成骨的關(guān)鍵因素[11]。關(guān)于糖尿病患者牙槽骨BMSCs的粘附、遷移能力的實(shí)驗(yàn)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)除了對各組BMSCs的增殖、凋亡、成骨分化潛能等進(jìn)行了研究，還對細(xì)胞的粘附和遷移能力進(jìn)行了研究。通過細(xì)胞黏附率的檢測發(fā)現(xiàn)，各組BMSCs在6小時(shí)的黏附率為75.54%～88.13%。而12小時(shí)的黏附率四組均可達(dá)到87%～91%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。姜煥煥等[12]使用成骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)親水性純鈦表面6小時(shí)和12小時(shí)的細(xì)胞黏附率接近90%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。進(jìn)一步通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，鈦片表面可見到BMSCs附著，細(xì)胞形態(tài)呈梭狀，邊緣有偽足伸出，細(xì)胞多尚未完全展開，偽足伸展不充分，細(xì)胞核體積較大，各組之間形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯差異。本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間點(diǎn)為6小時(shí)和12小時(shí)，這考慮到BMSCs在接種后2～3小時(shí)開始粘附、貼壁，隨著時(shí)間的增長比如24小時(shí)后，細(xì)胞的增殖可能會影響細(xì)胞黏附率的檢測。

目前關(guān)于BMSCs在體內(nèi)或體外的遷移規(guī)律的研究，特別是在損傷組織和病理?xiàng)l件下遷移的特性的研究還比較少。關(guān)于細(xì)胞遷移能力的檢測主要有Transwell遷移小室和劃痕方法(wound healing)。Transwell法應(yīng)用范圍較廣，不受實(shí)驗(yàn)條件限制，但是價(jià)格比較昂貴，相反劃痕法只需無菌移液管即可，比較方便經(jīng)濟(jì)[13]。細(xì)胞劃痕法是簡捷測定細(xì)胞遷移運(yùn)動與修復(fù)能力的方法，類似體外傷口愈合模型，在體外培養(yǎng)皿培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用無菌移液管或其它硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察周邊細(xì)胞是否生長(修復(fù))至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長遷移能力。通過劃痕法進(jìn)行細(xì)胞遷移能力測定，發(fā)現(xiàn)6小時(shí)和24小時(shí)后正常人BMSCs在高糖和低糖環(huán)境下遷移距離明顯大于糖尿病患者BMSCs的遷移距離，正常人組劃痕兩側(cè)的BMSCs 24小時(shí)后幾乎融合在一起，而糖尿病患者劃痕兩側(cè)細(xì)胞尚有一定的距離。這說明糖尿病患者牙槽骨BMSCs的遷移(修復(fù))能力較差，這可能也是糖尿病患者種植骨結(jié)合稍差的原因。而且，我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DM患者BMSCs成骨分化能力比正常人BMSCs成骨分化能力差，推測糖尿病患者BMSCs生物學(xué)特性較正常人減弱，從而影響骨改建[14]，但是引起這些生物學(xué)行為改變的分子機(jī)制尚不清楚，還需要我們進(jìn)一步研究。