大鼠非酒精性脂肪肝肝郁脾虛證的尿液代謝組學研究?

李若瑜，苗宇船，李明磊，劉 楊，郭繼龍，關 偉，張冉冉

(山西中醫藥大學，山西 晉中 030619)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是代謝綜合征在肝臟的表現，是以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的遺傳-環境-代謝應激相關性疾病。本研究采用核磁共振技術(1H-NMR)，結合3種模式判別分析方法，對NAFLD肝郁脾虛證模型大鼠的尿液進行代謝組學分析，探討NAFLD肝郁脾虛證體內的代謝變化。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SPF級7周齡SD大鼠16只，體質量(210±10) g，購自北京海淀興旺實驗動物養殖場(實驗動物合格證號SCKK(京)2014-0013)。常規適應性飼養1周后進行實驗，實驗方案經山西中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(批準號2015007)。

1.2 試劑與儀器

D2O購自美國merck試劑公司；TG、TC、ALT試劑盒均購自中生北控生物科技股份有限公司(批號分別為146851、141741、1007150)；600 MHz AVANCE III NMR波譜儀，德國Bruker公司；Avanti J-26XP 低溫超速離心機，美國BECKMAN公司。

1.3 主要方法

1.3.1 NAFLD肝郁脾虛證動物模型的復制 將實驗大鼠按隨機數字表法分為對照組和模型組各8只，對照組常規飼養，模型組依課題組既往實驗方法，給予高糖高脂飼料+饑飽失常法+夾尾法+慢性束縛應激刺激，復制NAFLD肝郁脾虛證動物模型[1-3]。動態觀察大鼠一般行為學特點，并于12周末通過代謝籠收集大鼠12 h尿液，3000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃冰箱中凍存待測；造模結束后，根據精神狀態、舌質、飲食、腹脹、兩便、毛色、眼睛、尾部等癥狀和體征建立大鼠證候積分評價量表，計算大鼠的肝郁脾虛證候積分[4]。大鼠經腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血制備血清，全自動生化儀檢測血清ALT含量；常規分離肝組織，取肝右葉制備10%肝勻漿檢測TC、TG含量；取肝左葉石蠟包埋切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織學變化情況。

1.3.2 1H-NMR代謝組學研究 (1)樣本預處理：取解凍后的尿液500 μL，加入D2O配制的PBS緩沖液200 μL，4℃下13000 r/min離心20 min，取上清液600 μL，置于內徑5 mm的NMR樣品管中進行核磁分析。(2)1H-NMR測定條件與圖譜處理：在600 MHz AVANCE III NMR波譜儀上采集數據，采用 1D NOESY 脈沖序列，參數設置為自旋弛豫延遲320 ms，譜寬8000 Hz，掃描64次。采用 Mest Re Nova 核磁圖譜專業處理軟件對所有1H-NMR圖譜進行傅立葉轉換并進行相位、基線調整。在1H-NMR圖譜中尿液樣本以TSP 的化學位移δ 0為標準進行化學位移校正。以δ 0.01為單位，對δ 0.01～10.50區域的譜圖進行等寬度分割并去除δ4.65～4.90區域的水峰；對圖譜進行分段積分，將積分數據歸一化處理,使數據集中在0～1內用于多元統計分析。

1.4 統計學方法

2 結果與分析

2.1 病證模型結果

2.1.1 一般行為學特點 模型組大鼠表現為明顯厭食，體質量減輕，行動遲緩，弓背靜臥，背毛散亂無光澤，腹圍增加，糞便溏軟。

2.1.2 肝功能、肝脂含量及證候積分 表1顯示，與對照組比較，模型組血清ALT和肝組織中TG、TC含量顯著增高(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組大鼠生化指標及證候積分比較(分，

注:與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.1.3 NAFLD病理組織學結果 圖1顯示，對照組大鼠肝組織形態正常；模型組肝細胞胞質內有大小不等的脂肪空泡，細胞核被擠壓至一側，門管區、肝小葉周圍炎細胞浸潤，提示NAFLD模型復制成功。

注：A為對照組，B為模型組，→所示為肝細胞內的脂肪空泡，將細胞核擠向一側；■所示為炎細胞浸潤圖1 大鼠肝組織病理切片(HE染色 ×400)

2.2 代謝組學結果

2.2.1 1H-NMR圖譜的指認與分析 圖2顯示，參照加拿大人類代謝組數據庫(HMDB)，結合每個代謝物的化學位移、峰型及耦合常數，通過對實驗大鼠尿液1H-NMR圖譜的指認與分析，共指認出26種代謝產物。

2.2.2 尋找差異代謝物 圖3、4顯示，運用SIMCA-P+ 進行PLS-DA分析，得出積分圖和S-plot圖。圖3中模型組與對照組明顯沿t[1]軸分開，提示組間差異明顯，模型的R2X=0.688，R2Y=0.995，Q2=0.907，即其中68.8%的變量作為主要成分構造模型，模型的解釋率為99.5%，模型的預測率是90.7%。圖4中“S”曲線上的點離原點越遠其VIP值越大，代謝產物的差異越明顯。運用SPSS17.0軟件對所有代謝物的相對峰面積進行兩獨立樣本t檢驗，以具有顯著差異(P<0.05)者結合S-Plot圖的VIP值進行多元統計，可以找到12種VIP>1的差異顯著的代謝產物。

注：1.乙酸[1.93(s)]；2.丙氨酸[1.48(d,J=7.2 Hz)]；3.尿囊素[5.39(s)]；4.苯甲酸[7.49(t,J=7.2 Hz),7.56(t,J=7.2 Hz),7.88(t,J=7.2 Hz)]；5.檸檬酸[2.61(dd,J=90 Hz)]；6.肌酐[3.05(s),4.06(s)]；7.二甲胺[2.76(s)]；8.二甲基甘氨酸[2.93(s)]；9.富馬酸[6.51(s)]；10.甲酸[8.46(s)]；11.甘油[3.53(dd, J=9.0 Hz)]；12.甘氨酸[3.57(s)]；13.α-D-葡萄糖[5.21(d,J=3.6Hz)]；14.胍基乙酸[3.80(s)]；15.3-羥基丁酸[1.26(s),2.35(s)]；16.異亮氨酸[3.76(d,J=6.0 Hz)]；17.α-酮戊二酸[2.45(t,J=6.6 Hz),3.02(t,J=6.6)]；18.乳酸[1.34(d,J=7.2 Hz)]；19.亮氨酸[0.94(t,J=6.0 Hz)]；20.賴氨酸[3.01(t,J=6.6 Hz)]；21.甲基胍[2.83(s),3.37(s)]；22.甲胺[2.61(s)]；23.琥珀酸[2.41(s)]；24.牛磺酸[3.27(t,J=6.6 Hz)3.42(t,J=6.0 Hz)]；25.胡蘆巴堿[4.44(s)]；26.三甲胺[2.88(s)]圖2 大鼠尿液1H-NMR圖譜

圖3 大鼠尿液1H-NMR下PLS-DA散點圖

圖4 大鼠尿液1H-NMR下S-plot圖

2.2.3 各差異代謝物含量變化趨勢及代謝途徑 表2顯示，與對照組比較，模型組各差異代謝物含量的變化趨勢可由相對峰面積表示[5]；通過查閱文獻，可知各差異代謝物在NAFLD肝郁脾虛證中涉及的代謝途徑。

3 討論

本實驗模型組大鼠高糖高脂飲食+饑飽失常造成脾胃損傷；慢性束縛、夾尾令其活動受限，造成情緒受抑、情志不遂而致肝郁，模擬了肝郁脾虛證的發病過程，其證候積分及已在另文論述的腦組織去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)含量和尿D-木糖排泄率等指標均符合肝郁脾虛證標準[3,6]。NAFLD 多與飲食不節、情志失和、久坐少動或臟腑功能失調有關，其中肝郁脾虛是 NAFLD 的基本病機。蓋因肝郁氣滯、木郁克土，病初肝失疏泄，脾失健運，木郁土壅，導致津液失調、濕濁不化和聚濕成痰；病久則氣血瘀滯，痰瘀交阻，濕、濁、痰、瘀相因成病，膠結難解，積于肝內成為NAFLD的病理基礎。大鼠肝內TC、TG均顯著高于對照組，即肝內脂肪蓄積增多，提示濕濁痰瘀郁阻于肝。

本研究采用1H-NMR譜對NAFLD肝郁脾虛證大鼠尿液的代謝產物進行了分析，結果表明模型大鼠主要存在能量代謝障礙、胰島素抵抗等方面的異常，其中能量代謝障礙包括糖代謝途徑、脂質代謝途徑和氨基酸代謝途徑的異常，這與近年來的臨床研究結果相一致[7]。

模型組大鼠尿液中葡萄糖、α-酮戊二酸明顯高于對照組，提示肝郁脾虛證大鼠葡萄糖利用率降低，三羧酸循環封閉[8]；琥珀酸是三羧酸循環的中間產物，乳酸是葡萄糖無氧代謝終產物，琥珀酸、乳酸含量下降，提示大鼠三羧酸循環受阻，能量代謝障礙。機體正常的代謝有賴于脾胃的運化與輸布功能，脾虛不能運化水谷精微，氣血化生乏源，則機體能量來源不足，又兼氣血津液不能正常輸布，臟腑不得濡養，則見模型組大鼠神疲乏力、倦怠嗜臥、背毛散亂無光澤。脾虛影響胃的受納功能，可見厭食；運化失司，水濕下注腸道，故見糞溏。

以甘油三脂為主的脂質在肝臟沉積，是NAFLD的基本病理過程。二甲胺在膽堿清除肝臟脂肪時產生隨尿液排出，大鼠尿液中甘油、二甲胺含量升高提示大鼠肝臟脂肪過多，膽堿分解增加，脂質代謝紊亂。模型組大鼠尿液中牛磺酸、乙酸含量降低，可能是因為高脂飲食的攝入，在大鼠肝臟消耗了大量牛磺酸和乙酸的結果[9]。脂質代謝障礙在中醫責之于肝失疏泄、乘克脾土、脾虛失運、水津不行則聚濕生痰，釀脂為膏結于肝內。模型組大鼠腹圍增加，肝臟生化檢測結果及肝細胞病理學結果都提示脂質代謝異常。

肝臟作為氨基酸代謝的中心，任何肝損傷都可能干擾氨基酸的代謝[10]。模型組尿液中異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸含量的降低，可能是由于肝臟功能發生障礙，糖代謝供能減少，使機體內源性蛋白質分解大于合成，釋放大量氨基酸用以供能所致。分解的內源性蛋白質主要來源于肌肉，由于肌肉含量降低，導致模型大鼠肌酐的生成和排出減少。而肌肉組織內源性蛋白質分解增加，則見形體消瘦、體質量減輕。《素問·經脈別論篇》指出：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，水精四布，五經并行。”脾胃運化水谷，輸布精微，內養臟腑，外充形體，灌益肌膚[11]。脾氣虛不能輸布精微，氣血津液不能充達肢體、肌肉，則見大鼠形體消瘦，行動遲緩。

胰島素抵抗﹙insulin resistance，IR﹚是代謝性疾病如2型糖尿病、心血管疾病、NAFLD等發展過程中重要的病理學基礎[12]。IR最直觀的判定特征就是葡萄糖的攝取利用障礙，模型組大鼠糖代謝紊亂、三羧酸循環封閉等表現，提示大鼠肝郁脾虛證應與胰島素抵抗有關。乙酸對IR有不同程度的預防作用[9]，可抑制肝甘油三酯累積，減輕氧化應激，抑制肝糖異生。甘氨酸能有效減輕肝臟脂變程度和炎癥反應，降低NAFLD大鼠血液中內毒素和ALT、AST、甘油三酯水平，抑制脂質過氧化反應，減輕胰島素抵抗，保護肝細胞。本實驗中模型大鼠尿液中乙酸和甘氨酸減少，可能與胰島素抵抗相關。肝氣郁結、脾氣壅滯、化生痰瘀是IR的中醫病機基礎[11]。木郁土壅，則水谷精微之清陽不升，病理產物之濁陰不降。《素問·奇病論篇》曰: “甘者令人中滿，故其氣上溢。”“木郁”與“土壅”互為因果，膏濁搏結積聚于肝發為NAFLD。

表2 差異代謝產物相對峰面積變化及代謝途徑比較

注: 與對照組比較:*P<0.05,**與對照組比較：P<0.01

尿液是機體整體對內外環境變化后產生各種反應最后的終端和結果，包含了數千種機體各種物質和通路代謝后的終產物，通過獲取尿液代謝物變化的信息可以逆推疾病的病位、病性、病機及傳變特點，這與中醫“據外揣內”有很大的內在同一性，充分體現了中醫“整體觀念”與個體化辨證的思路。

本研究利用代謝組學技術檢測大鼠尿液中12種內源性代謝物含量的變化并進行綜合分析，從生物代謝的角度闡釋肝郁脾虛證的病機過程，為尋找中醫證候的代謝標志物、闡明證候的生物學本質提供新的方法與思路，未來有望對肝郁脾虛證候的診斷乃至治療提供理論依據。