大黃附子湯作用機制的靶標與通路探討

趙金龍，陳國銘，鄺梓君，湯順莉，黃 雁，陳子茵，張培嬋，劉韻韻，唐純志△

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405； 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405)

經(jīng)典中藥復(fù)方大黃附子湯來源于《金匱要略》，此方包含大黃、附子及細辛3味中藥，功效為溫里散寒、通便止痛，主治寒積里實證[1]。在較多文獻研究和臨床實際應(yīng)用中，大黃附子湯主要用于治療消化系統(tǒng)[2]、腎病[3-4]、痛證、婦科疾病等系統(tǒng)或疾病[5]。霍黎生[6-7]、張林軍[8]等報道了大黃附子湯在治療功能性便秘方面的優(yōu)勢和顯著療效。吳麗[8]等報道了大黃附子湯治療急性胰腺炎的作用機理。陳偉平[3]等報道了大黃附子湯治療慢性腎衰竭的臨床療效，反饋較好。由于附子與細辛具有一定的毒性，也在一定程度上限制了該方的推廣，其作用機制及原理尚未完全闡明，因此研究大黃附子湯治療的作用機制及原理，對于推廣其臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)具有重要的臨床意義。

基于系統(tǒng)藥理學(xué)的推導(dǎo)方法，對該方設(shè)計的數(shù)據(jù)進行分析，將從分子層面及通路領(lǐng)域預(yù)測大黃附子湯作用機制，以期為大黃附子湯的臨床推廣應(yīng)用及開發(fā)新藥提供有力的循證支持。

1 資料與方法

1.1 大黃附子湯的化學(xué)分子信息庫

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)，以“大黃”“附子”“細辛”3個中藥成分作為中藥名檢索大黃附子湯的化學(xué)成分。

1.2 化合物的信息提取

通過口服方式表現(xiàn)出來的生物利用度，是藥物ADME中最重要的藥物代謝動力學(xué)中的一個參數(shù)，其代表口服藥物到達體循環(huán)所占口服劑量的多少，作用比率高的口服生物利用度也許是決定生物活性分子類藥性的重要指標[9]。本文研究以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)最低大于或等于30%和類藥性(druglikeness,DL)最低大于或等于0.18作為活性化合物的選取標準，將數(shù)據(jù)庫中具有較高活性的成分進行提取，以保證數(shù)據(jù)的有效性。

1.3 化合物與靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)筑

將該方相關(guān)的化合物及靶點通過軟件Cytoscape 3.5.1構(gòu)筑化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，并對其進行拓撲學(xué)數(shù)據(jù)分析，從而研討大黃附子湯的藥理學(xué)作用機理，其中靶點度值(Degree)和中介中心度(Betweenness Centrality)是拓撲學(xué)數(shù)據(jù)中2個關(guān)鍵參數(shù)，可以評判該方劑相關(guān)化合物和靶標的關(guān)鍵性。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

蛋白質(zhì)一般以相互組合的方式方能實現(xiàn)其生理學(xué)功能，因此蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析及研究是理解生命活動如生理過程等的基礎(chǔ)條件。為闡明靶點蛋白在系統(tǒng)層面的用途，將大黃附子湯相關(guān)的靶點輸入數(shù)據(jù)庫STRING 10.5，使用相關(guān)設(shè)置功能，將評分設(shè)為0.90及以上，以此提升信息的可信性。通過以上數(shù)據(jù)處理而導(dǎo)出蛋白互作的可視化圖，并根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)提取相關(guān)靶標蛋白的關(guān)聯(lián)頻數(shù)。

1.5 KEGG通路富集分析

KEGG(Kyoto Enclopedia of Genes and Genomes)是東京大學(xué)和日本京都大學(xué)共同開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，研究可以通過此信息庫進行相關(guān)通路的研究，且該信息庫與David在線互聯(lián)。為了闡明本研究方劑中相關(guān)化合物的靶點蛋白在信號通路中的作用機制，本文采用David v6.8數(shù)據(jù)庫對靶點蛋白進行信號通路富集分析，從而分析大黃附子湯所涉及的相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 大黃附子湯的有效化合物數(shù)據(jù)

表1顯示，通過TCMSP共提取到大黃附子湯中有效化合物349種，其中大黃含92種，附子含65種，細辛含192種。以O(shè)B 大于或等于30% 及DL 大于或等于0.18作為提取標準，篩選出活性化合物共45種，其中大黃含有16種，附子含有21種，細辛含有8種，所有化合物經(jīng)比對并去除重復(fù)化合物后共計有39種。

2.2 大黃附子湯化合物-靶點互作網(wǎng)絡(luò)

圖1顯示，化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中共計有164個節(jié)點(其中化合物節(jié)點共計有26個及靶點節(jié)點138個)和602條邊，其中化合物分子以紅色節(jié)點進行標注，藥物靶點以黃色節(jié)點進行標注，每條邊代表化合物和靶點之間相關(guān)性，其中共有13個化合物未進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)筑。在網(wǎng)絡(luò)中，一個節(jié)點度值的多少代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點之間相連邊的數(shù)量。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)的特點，選取度值較大的節(jié)點進行探討分析。表2顯示，化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點及其拓撲學(xué)性質(zhì)。網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)相關(guān)結(jié)果如下，網(wǎng)絡(luò)集中度0.368，網(wǎng)絡(luò)密度0.023，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性1.916，最短路徑26732(100%)。平均度值結(jié)果3.670731707，大于平均度值的節(jié)點共計35個；節(jié)點平均中介中心度0.013573227，大于平均中介中心度的節(jié)點共計22個。根據(jù)節(jié)點的度值和中介中心度等拓撲學(xué)特征選用核心節(jié)點分析。這些連接化合物或靶點較多的節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中甚至起到?jīng)Q定性的作用，可能是核心的化合物或靶點。

表1 大黃附子湯化合物信息特征表

圖1 化合物-靶標關(guān)系圖

節(jié)點名稱節(jié)點類型節(jié)點度值中介中心度kaempferol化合物630.45727971beta-sitosterol化合物380.21146257Cryptopin化合物280.13304807(3S)-7-hydroxy-3-(2,3,4-trimethoxyphenyl)chroman-4-one化合物260.11886808aloe-emodin化合物240.15672641sesamin化合物230.22268755Prostaglandin G/H synthase 2靶點170.21662085EUPATIN化合物160.04435578Nuclear receptor coactivator 2靶點120.06152629Prostaglandin G/H synthase 1靶點120.05155499Heat shock protein HSP 90靶點110.04910038(-)-catechin化合物110.03680959Toralactone靶點90.013935424,9-dimethoxy-1-vinyl-$b-carboline化合物90.01425451Sodium channel protein type 5 subunit alpha靶點80.05156333Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit, gamma iso-form靶點80.02291593DNA topoisomerase II靶點70.04485815Calmodulin靶點70.0253232mRNA of PKA Catalytic Subunit C-alpha靶點70.03393374Coagulation factor Xa靶點60.03398017Alpha-1B adrenergic receptor靶點60.01840589

網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析最后表明，山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)等是大黃附子湯的關(guān)鍵性化合物成分，前列腺素G/H合成酶2、熱休克蛋白HSP 90等是關(guān)鍵靶標。

山奈酚(kaempferol)是一種可從姜科植物山奈的根莖、槐樹果實等植物類果實或根莖中分離出來的有效成分[10]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果證明，它可抑制金黃色葡萄球菌(SA)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、傷寒桿菌(Salmonella typhi)等多種病原菌的生長， 具有抑制眼醛糖還原酶的作用，且能止咳祛痰兼具利尿等功效[11]。研究表明[12]， 山奈酚是一類作用較大的蛋白激酶 CK2抑制劑，CK2 具有其內(nèi)在的致瘤活性并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[13]，因此山奈酚可能具有一定程度抗瘤抑制作用。這一結(jié)論也與山奈酚對離體人子宮肌瘤細胞增殖具有抑制作用相符[14]。這也提示大黃附子湯可能具有抗瘤作用。

beta-sitosterol是植物甾醇類化合物—β-谷甾醇，有抗炎、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、防治前列腺肥大、抗氧化、降血脂、鎮(zhèn)痛、促進傷口愈合、調(diào)節(jié)骨代謝平衡、保護胃黏膜、治療癲癇等較多的藥理作用及活性[15-16]。β-谷甾醇具有抗炎抗炎的作用[17]，與現(xiàn)代藥理研究[18]β-谷甾醇具有較強抗炎作用不謀而合。大黃附子湯酊劑用于治療甲溝炎等炎癥[19]療效顯著，可能是此活性成分在其中起到重要作用，與臨床報道相符,從側(cè)面印證了大黃附子湯潛在的抗炎作用。

蘆薈大黃素(aloe-emodin)是一種蒽醌類生物活性成分，具有保護心血管系統(tǒng)、護肝、抗腫瘤、抗菌抗炎、免疫調(diào)整及瀉下等藥理作用[20]。有研究表明[21]，蘆薈大黃素可明顯降低 LPS誘導(dǎo)的 RAW264.7細胞 NO釋放，從而抑制NO的釋放量。而諸多文獻研究成果表明[22]，功能性便秘可能是由于P物質(zhì)、乙酰膽堿、NO等腸神經(jīng)遞質(zhì)異常而引起的。也有研究顯示，大黃附子湯在便秘治療中，其機制可能與腸神經(jīng)遞質(zhì)的分泌有關(guān)[23]。因此，大黃附子湯在治療功能性便秘疾病時，可能是其有效化合物成分蘆薈大黃素在其中調(diào)節(jié)NO等神經(jīng)遞質(zhì)而起到治療功能性便秘的治療效果。這與臨床上李虹[8]等運用大黃附子湯治療便秘取得良好的療效相符。且現(xiàn)代藥理學(xué)研究大黃附子湯得出結(jié)論[24]，其具有瀉下、興奮胃腸功能，與促進排便等藥理學(xué)功能相符。

前列腺素G/H合成酶2(Prostaglandin G/H synthase 2)被認為是“快速反應(yīng)基因”，通過一系列反應(yīng)起到抗炎抗癌作用[25]。Fujita H等研究發(fā)現(xiàn)，COX-2可以通過抑制前列腺癌細胞凋亡起到促進前列腺癌細胞增殖的作用，且COX-2與前列腺癌血管形成、癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[26]。鄧琳等研究表明，COX-2 可促進卵巢癌細胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強腫瘤細胞遷移能力[27]。COX-2作為炎性因子，會導(dǎo)致炎癥發(fā)生和紅腫熱痛，使用抑制劑對COX-2進行抑制則可減少這種反應(yīng)[28-29]。

熱休克蛋白HSP 90(heat shock protein HSP 90)作為一種分子伴侶，具有廣泛的生物學(xué)功能。張杰等[30]定量比較(狹縫雜交法檢測)22對人肝細胞癌(HCC)及其配對非癌肝組織(PNL)和2例正常肝(NL)組織中熱休克蛋白HSP90基因mRNA的表達水平,結(jié)果顯示HSP90基因mRNA在HCC中表達最高，PNL中次之，NL中最少。此結(jié)果提示，Hsp90變化表現(xiàn)的時間較遲，也許在已經(jīng)發(fā)生癌變的細胞中發(fā)揮某些作用，即可能與某些癌細胞如肝癌細胞的異常生長及轉(zhuǎn)移等相關(guān)。

從以上對關(guān)鍵化合物及靶標的深度分析，大黃附子湯化合物、靶標與抗癌、抗炎機制及胃腸道疾病的關(guān)系十分密切。

2.3 大黃附子湯PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

圖2、3顯示，為更好地理解與分析大黃附子湯的作用機制及原理，基于蛋白之間相互作用的關(guān)系，利用STRING構(gòu)造本方劑中相關(guān)靶標的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。設(shè)置置信度大于或等于0.90，去除孤立于網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)靶標蛋白，得到PPI網(wǎng)絡(luò)共計84個節(jié)點，470條邊，平均度值5.595238095，其中節(jié)點代表靶標蛋白，每條邊表示靶標蛋白之間的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)節(jié)點的度值繪制大于平均度值且度值較高的9個關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點的條形圖。度值較高的3位分別為JUN、RELA、TP53，其中JUN度值(度值為23)高于其他節(jié)點，說明這個蛋白在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了相對重要的作用，成為聯(lián)通網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點的關(guān)鍵節(jié)點。

圖2 大黃附子湯靶蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白質(zhì)信息條形圖

PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，JUN、RELA、TP53、CYP1A1、MAPK1等靶蛋白度值遠高于其他。c-jun蛋白水平的循環(huán)變化在腺上皮細胞的增殖和凋亡中是顯著的。c-jun蛋白的持續(xù)基質(zhì)表達可以防止基質(zhì)細胞在晚期分泌期進入細胞凋亡[31]。RelA/p65為NF-Kβ的亞單位，且在炎癥反應(yīng)及炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的過程中有著重要影響。NF-κB能夠引導(dǎo)單核巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，如白細胞介素2、6、12等，從而引起強烈的炎癥反應(yīng)[32]。研究顯示[33-34]，外源性物質(zhì)刺激生物體可以引起機體TNF-α和白細胞介素6等促炎因子的分泌，從而抗炎因子水平會降低，因而引起細胞因子水平的不平衡等，最終使得體內(nèi)炎癥的發(fā)生及發(fā)展。由此推測，大黃附子湯可能是通過作用于JUN、RELA等靶蛋白，從而調(diào)整IL-2等促炎因子在體內(nèi)的生物學(xué)活動，起到抗炎等生理功能。這與大黃附子湯在臨床治療急性胰腺炎[33-34]、腹膜炎[35]等炎癥疾病取得較好的臨床療效相符，從機制理論和臨床實際應(yīng)用層面證實了其抗炎作用。

正常情況下TP53的活性很低，當機體受到外界刺激而引起機體DNA受到損害時其活性會提高。研究顯示，TP53基因的變化，可能與肝細胞癌的發(fā)生有較大聯(lián)系[36]。TP53突變/蛋白質(zhì)分子的表達可能是2級星形膠質(zhì)細胞瘤復(fù)發(fā)惡性進展的預(yù)示指征[37]。有研究認為[38]，TP53基因是一種非常重要的抑癌基因，其編碼的蛋白p53能讓眾多基因保持相對穩(wěn)定性，并調(diào)控細胞的相關(guān)生理過程，從而避免疾病的發(fā)生。TP53在大黃附子湯PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較高，因此其作用也不可忽視。由此推測，大黃附子湯有其內(nèi)在的抗瘤作用及活性，可能是通過TP53基因蛋白的作用而發(fā)揮抗瘤的生物學(xué)功能。

2.4 KEGG通路富集分析

表3顯示，使用David v6.8數(shù)據(jù)庫對大黃附子湯靶蛋白基因進行信息通路富集，結(jié)果共有122條生物信息通路，計算每條富集通路的p值(P 值小于0.01為顯著富集)，對P值排序后取前10名進行分析。

為更深層次地探究大黃附子湯作用靶點在生物信號通路層面的機理，本文利用KEGG通路富集對大黃附子湯靶標基因進行研究。結(jié)果表明，差異有統(tǒng)計學(xué)意義的10條相關(guān)通路分別是Chemical carcinogenesis、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Hepatitis B、Drug metabolism- cytochrome P450、Steroid hormone biosynthesis、Retinol metabolism、Drug metabolism- other enzymes、Colorectal cancer、Pentose and glucuronate interconversions、Ascorbate and aldarate metabolism。由上述KEGG富集結(jié)果分析可知，大黃附子湯與化學(xué)致癌相關(guān)通路、細胞色素P450相關(guān)通路及視黃醇代謝等相關(guān)通路有較大聯(lián)系。因此本文試圖從以上幾個主要方面進行機制探討與分析，試圖理解大黃附子湯在基因功能及信號通路層面的作用機制。

表3 KEGG通路富集情況表(Top 10)

細胞色素P450不僅是內(nèi)源性物質(zhì)的代謝酶，同時也是外源性物質(zhì)的代謝酶，參與的代謝有致癌物質(zhì)和臨床藥物治療等，并具有重要的生物學(xué)功能如激素合成、外源物質(zhì)降解、致癌物質(zhì)消除等[39]。其中，CYP1A1等為細胞色素P450的亞型。與PPI網(wǎng)絡(luò)中CYP1A1出現(xiàn)在度值較高具有某種內(nèi)在聯(lián)系，說明細胞色素P450及其亞型CYP1等在其相關(guān)通路中發(fā)揮著重要作用。有研究表明[40-41]，CYP1A1的多態(tài)性基因或許會提高乳腺癌的患病概率。同時也有相關(guān)研究指出，有一類細胞保護機制是表達CYPs，如某些腫瘤細胞會通過此途徑提供給癌細胞某一類未知的解毒藥物或?qū)Π┘毎泻Φ奈镔|(zhì)，從而提高相關(guān)癌細胞的生存幾率[42]。由此本文認為，大黃附子湯可能是通過細胞色素P450相關(guān)通路，調(diào)整CYP1等亞型破壞腫瘤細胞的保護機制，從而起到治療癌癥的作用。

3 討論

本文運用系統(tǒng)藥理學(xué)對大黃附子湯的作用機制及原理進行分子機制、基因及信號通路等層面的分析，認為大黃附子湯可能是其核心化合物山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)等通過Chemical carcinogenesis、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450等相關(guān)通路作用于JUN、RELA、TP53、CYP1A1、MAPK1等靶標而起治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃附子湯在治療消化系統(tǒng)疾病方面如便秘具有很強的科學(xué)性，由化合物-靶標網(wǎng)絡(luò)分析可知，其可能是通過蘆薈大黃素(aloe-emodin)等化合物、靶標及相關(guān)通路促進排便從而治療便秘。這與大黃附子湯傳統(tǒng)用法及現(xiàn)代臨床應(yīng)用[8,43]相符合，同時也驗證了其在臨床上具有抗炎活性的理論機制，如臨床應(yīng)用其治療如胰腺炎、腹膜炎等炎癥疾病。由PPI分析、David通路富集分析可知，大黃附子湯在理論上具有抗癌抗瘤潛在作用機制，但是臨床及基礎(chǔ)實驗研究中極少提及大黃附子湯在治療癌癥疾病方面有特別之處。因此，大黃附子湯是否具有抗癌抗瘤作用及其臨床療效如何，可以作為今后研究的一個方向。