肛門洗劑對肛瘺模型大鼠創(chuàng)面組織修復(fù)作用及創(chuàng)面血管生長相關(guān)因子、炎癥相關(guān)因子、FGF蛋白的影響?

謝昌營，吳成成，肖慧榮

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006)

肛瘺是一種反復(fù)發(fā)作的肛腸疾病，主要有流膿、疼痛、瘙癢等局部癥狀，急性炎癥時還可出現(xiàn)發(fā)熱、消瘦等全身癥狀且不能自愈。肛瘺術(shù)后創(chuàng)口易被糞便污染，一般不做縫合，因此創(chuàng)面修復(fù)成為影響預(yù)后的重要因素[1]。肛瘺創(chuàng)面修復(fù)主要包括炎癥反應(yīng)階段、細(xì)胞增殖階段及組織重塑階段[2]，前兩個階段的發(fā)展走向直接影響肛周組織重塑。因此，減輕炎癥反應(yīng)，增快肛周組織細(xì)胞增殖，已然成為治療肛瘺術(shù)后的研究方向和熱點(diǎn)。

《醫(yī)學(xué)流源論》指出：“外科之法最重外治”，說明外治法在治療外科疾病方面占據(jù)著首要地位。肛門洗劑是肖慧榮主任醫(yī)師通過多年研究而得，在臨床中對肛瘺、混合痔術(shù)后創(chuàng)面愈合均有明確療效[3-4]。肛瘺術(shù)后減輕早期炎癥反應(yīng)，重塑創(chuàng)面局部微循環(huán)，是提高肛瘺術(shù)后創(chuàng)口愈合率的關(guān)鍵因素[5-6]。成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、分化及血管再生。有研究證實(shí)，F(xiàn)GF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮增殖效應(yīng)強(qiáng)于血小板生長因子[7]。本研究擬采用大鼠背部肛瘺造模法，觀察肛門洗劑對肛瘺模型大鼠創(chuàng)面愈合及創(chuàng)面血流量的影響，并檢測新生肉芽組織中血管生長相關(guān)因子、炎癥相關(guān)因子、FGF的變化，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

高錳酸鉀(濟(jì)南?？瞪镏扑幱邢薰?；氯胺酮(福建古田藥業(yè))；HE染色試劑盒(Solarbio公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；MI191型激光多普勒血流儀(上海埃德國際貿(mào)易公司)；VE-180型垂直板電泳裝置(上海天能科技有限公司)；1703940型半干轉(zhuǎn)膜儀、1708159型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio Rad公司)；前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Assay公司)；白介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)，白介素-2(interleukin-2， IL-2)ELISA試劑盒(中國欣博盛)；血管生長因子(vascular growth related factors，VEGF)、胎盤生長因子(placental growth factor， PLGF)、促血管生成素-Ⅰ(angiopoietin-Ⅰ，Ang-Ⅰ)、促血管生成素-Ⅱ(angiopoietin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)ELISA試劑盒(美國Cygnus公司)；低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)ELISA試劑盒(美國Abcam公司)；成纖維細(xì)胞生長因子-1(FGF-1)、成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)、成纖維細(xì)胞生長因子-6(FGF-6)一抗(美國Abcam公司)。

1.2 肛門洗劑組成及制備

肛門洗劑組成：五倍子60 g，苦參60 g，明礬20 g，樸硝20 g，桑寄生20 g，荊芥20 g，黃柏20 g，白及20 g，月石20 g，百部20 g，藥物購自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房(批號20140101)。制法：將肛門洗劑原飲片粉碎成粗粉，加水 2 000 mL浸泡 15 min 后武火煮沸煎至500 mL，去渣存液，每150 mL 為1包，使用時按1∶4 稀釋后擦洗創(chuàng)面，紗布包扎。

1.3 動物模型制備及分組

選取清潔級雄性SD大鼠64只，體質(zhì)量(200±20)g，周齡8～10周，由江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗動物中心提供(實(shí)驗動物許可證號SCXK(贛)2017-019)。采用氯胺酮100 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，對入組大鼠術(shù)區(qū)備皮及消毒， 于頸后2.5 cm脊柱旁側(cè)0.5 cm切割直徑1.8 cm圓形創(chuàng)口，達(dá)肌層0.3 cm深度，止血后創(chuàng)面加糞液1 mL，油紗、敷料固定48 h，以創(chuàng)口有膿性分泌物、有糞臭者為成功標(biāo)準(zhǔn)[8]。將64只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、肛門洗劑組及陽性對照組各16只，對照組大鼠造成背部肌層創(chuàng)傷后不敷以糞便，模型組大鼠造模成功后不給予任何藥物涂抹，正常組與模型組均給予0.9%NaCl溶液創(chuàng)面擦洗，每日2次；肛門洗劑組大鼠給予肛門洗劑藥液擦洗創(chuàng)面，每日2次；陽性對照組給予高錳酸鉀溶液(1∶5000)，每日2次，各組大鼠均連續(xù)干預(yù)14 d[9]。

1.4 創(chuàng)面愈合率

參照潘友珍等[10]方法測量創(chuàng)傷面積，并計算藥物治療7 d、14 d創(chuàng)面愈合率。愈合率=(原始創(chuàng)面面積-當(dāng)前創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.5 創(chuàng)面局部血流量、新生毛細(xì)血管數(shù)檢測

采用激光多普勒血流儀，將 MSP 200xp 表面探頭放置在肛瘺內(nèi)口創(chuàng)面上，每個創(chuàng)面分別選肛瘺內(nèi)口的頂端及瘺道走向上任意2點(diǎn)(總計3個點(diǎn))，每點(diǎn)記錄30 s，采用 PowerLab Chart5 v5.2.2 圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，計算3點(diǎn)平均值作為該內(nèi)口創(chuàng)面的血流值。實(shí)驗第7天、14天取各組大鼠內(nèi)口相近處肉芽組織，經(jīng)10%甲醛固定液固定 45 min后，石蠟包埋、切片，行常規(guī)HE染色。采用光學(xué)顯微鏡對HE切片進(jìn)行新生毛細(xì)血管數(shù)觀察，并采用MPIAS-400 計算機(jī)彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定新生毛細(xì)血管總面積。

1.6 血管生長相關(guān)因子及炎癥相關(guān)因子檢測

于實(shí)驗第7天，在各組大鼠中隨機(jī)選取8只取部分肉芽組織，由于切取肉芽組織后影響藥物干預(yù)14 d創(chuàng)口面積綜合數(shù)據(jù)，取樣后處死，其余大鼠于實(shí)驗結(jié)束取材后處死。冷研磨后加入細(xì)胞裂解液2 mL制備組織勻漿，用ELISA法檢測治療7 d、14 d肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ、IL-1β、IL-2及PGE2表達(dá)，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.7 創(chuàng)面組織FGF-1、FGF-2、FGF-6表達(dá)

剪取部分創(chuàng)面肉芽組織冷研磨后加入細(xì)胞裂解液，在4 ℃條件下以2000 r/min進(jìn)行離心，測定蛋白量后制備上樣液。取各組待測樣品20 μg加至SDS-PAGE電泳中，轉(zhuǎn)膜后脫脂牛奶封閉2 h，加入anti-FGF-1(1∶1000)、anti-FGF-2(1∶1000)、anti-FGF-6(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次加入二抗anti-rabbit(1∶1000)，24 ℃條件下孵育2 h，洗膜3次后暗室曝光掃描。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面局部血流量、新生毛細(xì)血管數(shù)及其總面積

表1顯示，與治療7 d比較，治療14 d正常組、肛門洗劑組及陽性對照組大鼠創(chuàng)面局部血流量、新生毛細(xì)血管數(shù)、總面積及創(chuàng)面愈合率均升高(P<0.05)；與正常組比較，模型組治療7 d、14 d創(chuàng)面局部血流量、新生毛細(xì)血管數(shù)、總面積及創(chuàng)面愈合率均降低(P<0.05)；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠治療7 d、14 d創(chuàng)面局部血流量、新生毛細(xì)血管數(shù)、總面積及創(chuàng)面愈合率均升高(P<0.05)。

表1 大鼠創(chuàng)面局部血流量、新生毛細(xì)血管數(shù)及其總面積比較

注:與本組7 d時比較：*P<0.05；與正常組同時間點(diǎn)比較：#P<0.05；與模型組同時間點(diǎn)比較：▲P<0.05

2.2 血管生成相關(guān)因子VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達(dá)情況

表2顯示，與治療7 d比較，正常組、模型組、肛門洗劑組及陽性對照組大鼠治療14 d后創(chuàng)面肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達(dá)升高(P<0.05)；與正常組比較，模型組治療7 d、14 d創(chuàng)面肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠治療7 d、14 d創(chuàng)面肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達(dá)升高(P<0.05)。

表2 大鼠創(chuàng)面肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ含量變化比較

注:與本組7 d時比較：*P<0.05；與正常組同時間點(diǎn)比較：#P<0.05；與模型組同時間點(diǎn)比較：▲P<0.05

2.3 創(chuàng)面肉芽組織炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-2及PGE2表達(dá)情況

表3顯示，與治療7 d比較，正常組、肛門洗劑組及陽性對照組大鼠治療14 d創(chuàng)面肉芽組織IL-1β、IL-2及PGE2表達(dá)降低(P<0.05)；與正常組比較，模型組大鼠治療7 d、14 d創(chuàng)面肉芽組織IL-1β、IL-2及PGE2表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠治療7 d、14 d創(chuàng)面肉芽組織IL-1β、IL-2及PGE2表達(dá)降低(P<0.05)。

表3 大鼠肉芽組織IL-1β、IL-2及PGE2含量變化比較

注:與本組7 d時比較：*P<0.05；與正常組同時間點(diǎn)比較：#P<0.05；與模型組同時間點(diǎn)比較：▲P<0.05

2.4 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織FGF-1、FGF-2、FGF-6表達(dá)情況

圖1表4顯示，與正常組比較，模型組大鼠治療7、14 d肉芽組織FGF-1、FGF-2及FGF-6表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠7、14 d肉芽組織FGF-1、FGF-2及FGF-6表達(dá)升高(P<0.05)。

表4 大鼠創(chuàng)口肉芽組織FGF-1、FGF-2、FGF-6表達(dá)變化比較

注:與本組7 d時比較：*P<0.05；與正常組同時間點(diǎn)比較：#P<0.05；與模型組同時間點(diǎn)比較：▲P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.肛門洗劑組；D.陽性對照組圖1 大鼠創(chuàng)口肉芽組織FGF-1、FGF-2、FGF-6表達(dá)比較

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，肛瘺病機(jī)多為肛癰潰后余毒未盡，結(jié)滯不散；或臟腑素虛，復(fù)感邪毒，氣血壅結(jié)，肉腐成膿。因此，清熱燥濕、補(bǔ)氣化瘀的原則應(yīng)貫穿肛瘺術(shù)后治療的始終。肛門洗劑由五倍子、苦參、明礬、樸硝、桑寄生、荊芥碳、黃柏、白及、月石、百部等10味中藥組成，方中重用五倍子收濕斂瘡，苦參瀉火療創(chuàng)，合而為君；百部、明礬、黃柏協(xié)同增強(qiáng)苦參殺蟲止癢功效，又燥濕清熱；五倍子佐以荊芥炭、白及共行止血止癢之功；桑寄生、白及、樸硝聯(lián)合可補(bǔ)益內(nèi)虛的同時可生肌消腫，加速創(chuàng)面愈合。本研究顯示，肛門洗劑可是肛瘺模型大鼠創(chuàng)面加速愈合，創(chuàng)口血流量、毛細(xì)血管數(shù)量明顯升高，說明肛門洗劑可能通過某些機(jī)制增加創(chuàng)口毛細(xì)血管數(shù)量，給局部創(chuàng)面愈合提供足夠血液，保障恢復(fù)創(chuàng)面的物質(zhì)基礎(chǔ)，增加創(chuàng)口愈合速度。

炎癥與創(chuàng)口血運(yùn)是影響肛瘺創(chuàng)面愈合的重要因素[11-12]，VEGF是目前已知的主要血管生長因子，HIF-1被認(rèn)為是低氧條件時形成毛細(xì)血管的主要效能物質(zhì)，并且HIF-1積累直接上調(diào)重要的促血管化因子VEGF[13-15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PLGF對微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的促增殖作用，還可促進(jìn)單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的游走，并增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[16]。Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ已被公認(rèn)均參與創(chuàng)傷后病理性血管生成，并且在修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用[17-18]。IL-lβ在急性炎癥中起重要作用，它可激活內(nèi)皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，可活化中性粒細(xì)胞，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)[19]。IL-2又稱T細(xì)胞生長因子，能夠活化T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體，激活巨噬細(xì)胞[20]。PGE2作為重要的炎性介質(zhì)，可以促進(jìn)白細(xì)胞趨化，在傷害性刺激的局部迅速產(chǎn)生，并激活周圍感覺神經(jīng)末梢疼痛受體，強(qiáng)化痛感[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，肛瘺模型大鼠創(chuàng)口肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ及Ang-Ⅱ表達(dá)降低，IL-1β、IL-2及PGE2表達(dá)升高，而經(jīng)肛門洗劑治療后上述血管生成相關(guān)因子及炎癥因子表達(dá)均明顯改善，說明肛門洗劑一方面可能通過降低炎癥相關(guān)因子表達(dá)，減輕創(chuàng)面的充血與滲出，并可能通過降低PGE2表達(dá)起到一定的鎮(zhèn)痛功效；另一方面，降低炎癥因子表達(dá)后，減少殺傷和包圍因子分泌，降低組織破壞程度，并促進(jìn)血管生長相關(guān)因子的表達(dá)，加快血運(yùn)重建，為組織修復(fù)階段提供營養(yǎng)物質(zhì)保障，從而達(dá)到加速創(chuàng)口愈合的作用。

為深入研究肛門洗劑促進(jìn)肛瘺模型大鼠創(chuàng)口其他深層相關(guān)機(jī)制。本研究對創(chuàng)口新生肉芽組中FGF家族蛋白進(jìn)行檢測。FGF-1是第一個被確認(rèn)的血管生長因子，可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重分部并分泌到細(xì)胞外與多種蛋白復(fù)合體進(jìn)行裝配，起到生成血管的作用[22]。FGF-2廣泛存在于機(jī)體組織內(nèi)，具有強(qiáng)烈的刺激細(xì)胞分裂增殖作用，對創(chuàng)面的修復(fù)起重要作用[23]。FGF-6在所有的肌源性組織中都有表達(dá)，Armand等通過研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-6既可刺激成肌細(xì)胞增殖、遷移，又可促進(jìn)肌肉分化、肥大，對創(chuàng)口組織肌肉修復(fù)起重要作用[24]。結(jié)果顯示，肛瘺模型大鼠創(chuàng)口肉芽組織FGF-1、FGF-2及FGF-6表達(dá)均下降，而肛門洗劑治療后FGF蛋白表達(dá)回升，說明當(dāng)出現(xiàn)創(chuàng)口時，可能由于炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，F(xiàn)GF家族蛋白表達(dá)被抑制，肛門洗劑則可通過影響FGF-1、FGF-2加速刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、排列，從另一角度說明肛門洗劑可促進(jìn)肛瘺創(chuàng)口血管再生的機(jī)制；而肛門洗劑促進(jìn)FGF-6的表達(dá)，則從肌肉再生角度證實(shí)肛門洗劑確有直接促進(jìn)肌細(xì)胞增殖、加速創(chuàng)口愈合的作用。

綜上所述，肛門洗劑提高肛瘺模型大鼠創(chuàng)口愈合率、創(chuàng)面局部血流量，其機(jī)制可能與降低創(chuàng)口新生肉芽組織炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-2及PGE2表達(dá)，并提高血管生長相關(guān)因子VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達(dá)及FGF家族蛋白有關(guān)，為臨床應(yīng)用肛門洗劑治療肛瘺補(bǔ)充可靠的科學(xué)依據(jù)，同時為進(jìn)一步探索肛門洗劑相關(guān)藥效奠定基礎(chǔ)。