邵氏“五針法”對哮喘模型大鼠肺組織а-SMA及FN表達的影響?

李 真，邵素菊

(1. 許昌市中醫院針灸科，河南 許昌 461000； 2. 河南中醫藥大學針灸推拿學院，鄭州 450008)

支氣管哮喘是呼吸系統的常見病和多發病之一。據統計，全球哮喘病患者有2.75億人左右。我國支氣管哮喘患病率大約為0.5%～6%[1],并以青少年和兒童居多[2]。本病多于夜間或清晨發作，大多數患者可自行緩解或經治療緩解，但是本病易反復發作，遷延難愈，極大地影響了患者的生活質量。尤其是出現持續狀態或大發作，若治療不及時不正確，會加重病情甚至危及生命。

全國名老中醫邵經明教授在大量的臨床實踐中，總結出治療哮喘的獨特療法邵氏“五針法”，即“肺俞” “大椎” “風門”穴。對此其前期也進行了多項實驗研究，但大多以炎癥機制為主。本研究將目光聚焦于哮喘的氣道重塑上。以氣道平滑肌和細胞間質為主要病理改變的氣道重塑作為哮喘發病的重要機理之一，具有十分重大的研究價值。a-SMA(平滑肌肌動蛋白-a)可調節氣道平滑肌收縮、遷移及生長。FN(纖維連接蛋白)能調節細胞生長、遷移、分化和細胞外基質沉積以及上皮下纖維化，二者均在哮喘氣道重塑中發揮重要作用。本研究通過對針刺前后哮喘模型大鼠肺組織中a-SMA及FN表達變化的觀察，探討邵氏“五針法”改善哮喘氣道重塑的作用機制及針刺治療哮喘的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 動物

選用40只體質量(140±20) g的健康雄性SD大鼠，購買于河南省實驗動物中心，在河南中醫學院動物實驗室進行飼養。將大鼠按隨機數字表法分為4組每組各10只。

1.2 試劑及儀器

卵蛋白(OVA)：美國Sigma公司(批號20130607)；地塞米松磷酸鈉注射液：規格1 ml，5mg；江蘇漣水制藥有限公司(批號1310513)；氫氧化鋁干粉：白銀化學試劑廠(批號20130717)；a-SMA、FN免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司提供(批號20130529B)；30號的0.5寸一次性毫針(“環球牌”0.30 mm×15 mm)；攤烤片機KT-218IV：湖北大維；自動包埋機 EG2150：德國徠卡；BH-2光學顯微鏡：Olympus公司；石蠟切片機RM3245：德國徠卡；MS彩色圖像分析系統：上海申騰技術有限公司。

1.3 研究方法

依據《肺臟免疫學及免疫相關性疾病》[3]的方法來建立大鼠哮喘模型。在研究第8天對大鼠進行致敏，空白對照組用生理鹽水腹腔注射，其余采用10%OVA抗原液1 ml取代生理鹽水。從致敏后第15天起，在密閉的霧化箱內使大鼠霧化吸入1%OVA溶液(空白對照組采用生理鹽水霧化)20 min激發哮喘，每日1次，共7次。每日霧化后進行治療，針刺治療組選取大鼠“肺俞”(雙) “大椎” “風門”(雙)[4]共針10 d。藥物治療組采用0.05%地塞米松磷酸鈉溶液腹腔注射，每日1次，共10 d。空白對照組用生理鹽水進行腹腔注射和霧化，模型對照組不做特殊治療。最后1次治療后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.35 ml/100 g)，然后迅速打開胸腔，剝離切取支氣管右中下肺組織(包括肺門)，用生理鹽水沖洗后迅速放入4%多聚甲醛中固定1周，切片待測進行免疫組化檢測。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠行為、癥狀、體征觀察

空白對照組：大鼠反應靈敏，行動敏捷，呼吸平穩，毛色光潔，飲食及大小便正常，生理鹽水霧化吸入后無明顯變化。模型對照組：OVA抗原激發后，大鼠出現噴嚏、嗆咳、流涕、呼吸急促、抓鼻撓腮、煩躁不安、張口喘息等哮喘樣表現，部分大鼠可聞及細小喘鳴音，反應遲鈍，動作遲緩。針刺治療組、藥物治療組：激發后體征同模型對照組。針刺或藥物治療10 min后，大鼠噴嚏、流涕、抓鼻撓腮、張口喘息癥狀明顯減輕，30 min后呼吸頻率、節律逐漸恢復正常，飲食、運動正常。

2.2 肺組織a-SMA和FN含量的表達

表1顯示，空白對照組大鼠肺組織中少見胞漿呈棕黃色染色的a-SMA及FN陽性細胞；模型對照組與空白對照組比較，大鼠肺組織內二者陽性表達明顯增多，差異有統計學意義(P<0.01)；針刺治療組和藥物治療組與模型對照組比較，肺組織內二者陽性表達顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)，但仍高于空白對照組。

表1 各組大鼠肺組織a-SMA、FN含量比較

注:4組比較：P=0.000<0.01；與空白組比較:☆P<0.01；與模型組比較：△P<0.01；與藥物治療組比較：▲P<0.01

圖1～4顯示，各組大鼠肺組織a-SMA免疫組化檢測結果。

圖1 空白對照組(免疫組化染色，10×40)

圖2 模型對照組(免疫組化染色，10×40)

圖3 藥物治療組(免疫組化染色，10×40)

圖4 針刺治療組(免疫組化染色，10×40)

圖5 空白對照組(免疫組化染色，10×40)

圖6 模型對照組(免疫組化染色，10×40)

圖7 藥物治療組(免疫組化染色，10×40)

圖8 針刺治療組(免疫組化染色，10×40)

大鼠肺組織中少見胞漿呈棕黃色染色的陽性細胞。與空白對照組比較，陽性表達顯著增多。與模型對照組比較，陽性細胞減少，α-SMA表達下降，但高于針刺治療組。 與模型對照組比較，陽性細胞減少，α-SMA表達下降，但仍高于空白對照組。圖5～8顯示，各組大鼠肺組織FN免疫組化檢測結果。大鼠肺組織中可見少量胞漿呈棕黃色染色的FN陽性細胞。與空白對照組比較，FN陽性表達顯著增多。與模型對照組比較，陽性細胞減少，FN表達下降但仍高于針刺治療組。與模型對照組比較，陽性細胞減少，FN表達下降。

3 討論

哮喘是一種反復發作的痰鳴氣喘疾患，中醫認為哮喘的發病是由于宿痰伏肺，若遇誘因引觸會使痰阻氣道、氣道痙攣，從而導致肺失肅降、氣逆于上而致痰鳴氣喘發作。哮喘宿根為痰，痰飲之產生常因肺不布散津液，脾不運化水濕，腎不蒸化水液，導致人體津液不歸正化，凝聚成痰，內伏于肺而發哮喘。哮喘初病者其病位在肺，病程日久者可累及脾腎，但仍關乎肺。

氣道平滑肌是哮喘氣道重塑過程中的重要靶器官， a-SMA作為氣道平滑肌的標志性指示物[5]，其生物學特性主要表現在，平滑肌中的粗細肌絲相互纏繞共同組成基本的收縮單位，它們是平滑肌收縮的結構基礎。其中細肌絲所占比例較大，細肌絲主要由肌動蛋白組成，起主要調節作用[6]。炎癥細胞及平滑肌細胞的趨化、游走和聚集主要依靠肌動蛋白纖維的伸展、收縮來實現，肌動蛋白含量的高低對平滑肌收縮能力具有直接影響。a-SMA不僅能夠表達于氣道平滑肌細胞，還可以表達于肌成纖維細胞，而且是肌成纖維細胞收縮能力的典型標志。a-SMA表達增多會刺激成纖維細胞轉化為具有收縮能力的肌成纖維細胞[7]，從而加重黏膜下層的纖維化，引起氣道重塑。a-SMA能夠促使氣道平滑肌的表型發生變化。哮喘時氣道平滑肌的改變以收縮型為主，收縮型的氣道平滑肌較分泌型表達更多的a-SMA[8]。a-SMA表達的增多會引起免疫反應性增高，加重氣道高反應性和氣道炎癥[9]。

細胞外基質(ECM)是維持氣道結構和功能的重要組成部分，它在氣道平滑肌細胞的刺激下可產生成纖維細胞，導致上皮下纖維化，二者相互作用可加重炎癥反應和氣道重塑。FN是細胞外基質的主要組成成分，其生物學特性主要表現為纖維連接蛋白是細胞外基質中最主要的黏連性糖蛋白，是細胞外基質的主要組成成分[10]。細胞外基質在氣道壁及肺間質沉積增多是哮喘氣道重塑的重要病理變化之一。細胞外基質可以控制細胞遷移的速度與方向，FN可通過與細胞表面(主要是成纖維細胞)的受體結合而形成纖維，使網狀層密度和厚度增加，促使上皮下纖維化的發生使基底膜增厚。氣道平滑肌表型的可塑性是通過各個肌細胞的可逆性調節和分化來實現的，肌細胞可在細胞外基質主要是FN的刺激下發生收縮-合成表型的改變[11]。在哮喘發作過程中，氣道上皮細胞能夠通過產生炎癥介質(如TGF-β1)刺激成纖維細胞，促進其合成和分泌多種細胞外基質，主要是纖維連接蛋白，從而增加上皮下細胞外基質沉積，使基底膜增厚而引起氣道重塑并加重氣道炎癥[12]。

通過對大鼠行為體征觀察、針刺或藥物治療后，大鼠的呼吸頻率、節律以及活動能力逐漸恢復正常。免疫組化檢測后發現，藥物治療組和針刺治療組中a-SMA和FN陽性表達均有所下降，且針刺治療組的陽性表達下降更為顯著。說明邵氏“五針法”降低炎性滲出的程度，減少平滑肌細胞的增生、肥大，減輕上皮下纖維化程度，使氣道高反應性下降，改善氣道重塑，從而抑制哮喘的發展。以上研究說明，邵氏“五針法”能夠降低a-SMA、FN在肺組織中的陽性表達，這是針刺改善氣道重塑、治療哮喘的作用機理之一。