酶聯免疫法測定水產品中己烯雌酚殘留量

張瑞凌，許亦真，劉建萍，李福偉，張沖

(1.齊魯工業大學(山東省科學院)，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東藍城分析測試有限公司，山東 濟南 250014)

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一種非甾體雌激素，能產生與天然雌激素相同的藥理與治療作用，于1938年由Dodds等[1]合成。己烯雌酚廣泛用于婦科病的治療，也作為動物促生長劑應用于畜禽生產中，同時在水產養殖等方面也有使用。多年研究證明，己烯雌酚對生物體具有致畸[2]、致癌[3]等危害。歐美等國從20世紀70年代開始先后頒布禁令，限制己烯雌酚的使用。1979年，世界各國開始嚴格控制己烯雌酚作為治療藥物使用[4]。2002年，《禁止在飼料和動物飲用水中使用藥物品種目錄》(農業部公告第176號)中禁止在飼料和動物飲用水中使用己烯雌酚及其鹽、酯和制劑[5]，《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》(農業部公告第193號)將其列為食品動物禁用獸藥[6]。在經濟利益驅使下，國內仍有將己烯雌酚用于水產養殖的現象。因此，選取一種快速、準確、靈敏的檢測方法檢測己烯雌酚殘留量，對于水產品的食品安全有重要意義。

目前用于己烯雌酚檢測的方法主要有高效液相色譜法[7]、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)[8]、氣相色譜-質譜聯用法[9]、放射免疫法[10]等。LC-MS/MS法分析結果準確，但前處理較為繁瑣，所需儀器設備使用和維護費用昂貴，且需專業人員操作，檢測成本高。酶聯免疫法是我國水產行業中己烯雌酚檢測的標準方法，具有靈敏度高、操作安全、檢測速度快、儀器成本低等優點。酶聯免疫法會出現假陽性結果，對操作人員的技術水平有一定要求，檢出限也相對較高。本實驗使用酶聯免疫法對大量實際樣品進行檢測，選取LC-MS/MS法驗證陽性樣品中己烯雌酚的含量，以提高樣品結果的準確性。

1 實驗材料和儀器

1.1 儀器

多功能酶標儀及操作軟件(美國BioTek公司)；氮吹儀(北京普立泰科儀器有限公司)；高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；旋轉蒸發儀(日本東京理化公司)；高速分散均質機(上海標本模型廠)；Agilent 1200 RRLC-6410型三重四級桿串聯質譜儀(美國Agilent公司)；Agilent 1200液相色譜儀(美國Agilent公司)；Eclipse XDB-C18色譜柱，2.1 mm×150 mm，5 μm(美國Agilent公司)。

1.2 試劑

己烯雌酚ELISA試劑盒(江蘇美正生物科技有限公司)；氯化鈉(上海國藥有限公司)；乙腈(美國Thermo Fisher Scientific)；乙醇(上海國藥有限公司)。

組織樣品為市售魚類，均來源于山東省內多地市超市及農貿市場。

1.3 儀器工作參數

質譜使用離子源：ESI，第一級四極桿溫度：100 ℃，第二級四極桿溫度：100 ℃，霧化壓力：206.844 kPa，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：12 L/min，離子極性：負，質量掃描模式： MRM模式，母離子質荷比為267，子離子質荷比分別為251和371，碎裂電壓均為140 V，碰撞能量分別為23 V和26 V。

液相色譜條件：以水(A相)和乙腈(B相)為流動相進行線性梯度洗脫，流速為300 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積10 μL。梯度洗脫條件：0～5 min，20%～50% B；5～7 min，50%～95% B；7～8 min，95%～95% B；8～8.01 min，95%～20% B；8.01～12 min，20%～20% B。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

取出樣品肌肉部分，剔除脂肪和結締組織，切成小塊后混勻，置冰箱中冷凍備用。

樣品解凍后勻漿，準確稱取1.0 g勻漿后的組織樣本到離心管中，加入1 mL 30%氯化鈉溶液和1 mL乙腈震蕩1 min，再加1 g中性氧化鋁和4 mL乙腈，震蕩5 min后，4000 r/min離心5 min；取上清液2 mL于50 ℃氮氣流下吹干；加入100 μL無水乙醇，震蕩30 s，再加入900 μL標品/樣本稀釋液震蕩混勻后，取上清作為樣本溶液。

2.2 檢測方法

將所需試劑及樣品置于室溫(20～25 ℃)平衡30 min以上；取50 μL標準品/樣本到對應的微孔中，然后每孔加入工作濃度酶標物50 μL，于25 ℃避光反應30 min；將孔內液體甩干，每孔加300 μL洗滌液，充分洗滌5次后，拍干；每孔分別加入底物液A液和B液各50 μL，避光于25 ℃反應15 min；加入終止液50 μL/孔，用雙波長450 nm/630 nm檢測，在5 min內讀完數據。

2.3 靈敏度實驗

分別做6次標準曲線，得出半抑制濃度(IC50)。分別測定10個陰性魚肉樣品，測定結果的平均值加上3倍標準偏差，即為檢出限。

2.4 準確度實驗

在空白樣品中進行低、中、高濃度加標回收實驗，共進行7批檢測。

3 結果與討論

3.1 靈敏度測定結果

以計算的標準溶液相對吸光度值為縱坐標，以己烯雌酚0.0、0.1、0.3、0.9、2.7 μg/L濃度的對數為橫坐標，分別做6次己烯雌酚標準液相對吸光度值與濃度的標準曲線，線性關系良好，如表1所示。

表1 己烯雌酚測定過程隨行工作曲線及相關系數

實驗測得10個陰性魚肉樣品中己烯雌酚含量分別為0.25、0.27、0.21、0.28、0.15、0.24、0.26、0.17、0.29、0.18 μg/kg，平均值為0.23 μg/kg，標準偏差為0.04 μg/kg，則該方法檢出限為0.35 μg/kg。

3.2 準確度測定結果

取陰性實際樣品加入相應濃度的標準溶液制備質控樣品，進行實際樣品加標回收率實驗，共進行7次加標，測得結果如表2所示。

表2 己烯雌酚加標回收率

續表2

7批陰性樣品在3個添加濃度的平均回收率在77%～91%，相對標準偏差2.20%～4.45%，說明該方法準確度良好。

3.3 假陰性率

用LC-MS/MS驗證隨機抽取的20份ELISA檢測得到的陰性樣品，均未檢出己烯雌酚殘留，則假陰性率為0，說明本方法具有良好的特異性。

3.4 假陽性率

檢測水產樣品260份，有1個陽性樣品，測定濃度為1.2 μg/kg。對該樣品用LC-MS/MS驗證，質譜結果見圖1。由圖1可以看出該陽性樣品經LC-MS/MS測定結果為陰性。

圖1 己烯雌酚標準品及樣品的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of standard DES and sample

4 結論

本文對酶聯免疫法定量檢測水產品中己烯雌酚的方法進行了驗證。該方法中己烯雌酚檢出限為0.35 μg/kg，加標回收率為77%～91%，方法滿足農業部發布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[11]的要求。本文采用的LC-MS/MS法避免了假陽性結果，酶聯免疫法靈敏、分析快速、操作簡單、檢測效率高，適合大批量樣品中己烯雌酚殘留的篩查。