文拉法辛對慢性束縛應激大鼠焦慮和抑郁樣行為的影響

趙洪慶，雷 昌，楊 嫻，何文龍，張思靜，韓遠山,2，王宇紅,2*

(1.湖南中醫藥大學，中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，長沙 410208；2.湖南中醫藥大學，科技創新中心，長沙 410208)

焦慮癥和抑郁癥是當今社會最常見的兩種神經精神疾病，兩者具有高度關聯性且多同時發生，為患者造成了很大的經濟負擔[1]。據WHO流行病學調查顯示，兩者共病比例可高達70%，且近80%的抑郁癥患者伴有明顯的焦慮癥狀，焦慮癥狀不僅能導致抑郁癥治療產生阻抗，也是增加其致殘率和致死率的重要原因[2]。因此，尋找兩種疾病的共性，并在此基礎上開展防治研究具有重要意義。大量文獻研究表明，慢性束縛應激能誘導嚙齒類動物的抑郁和焦慮樣行為，但對束縛時長及造模總時長有不同的報道[3-4]，本課題組前期通過對大鼠束縛時間(3 h、6 h)和慢性束縛應激總時長(7 d、14 d、21 d)篩選研究發現，21 d慢性束縛應激6 h能使大鼠表現出穩定的抑郁和焦慮樣行為，是研究抑郁與焦慮共患病的良好動物模型[5]。文拉法辛是一種新型抗抑郁藥，主要通過抑制5-HT和NE的再攝取來改善抑郁患者的臨床癥狀，臨床研究發現，文拉法辛治療抑郁癥伴發焦慮障礙患者效果要明顯優于氟西汀等常規抗抑郁藥[6]。然而，目前對文拉法辛的基礎研究都是從抗抑郁作用著手，并未明確其對動物焦慮樣行為的影響。基于此，本實驗以慢性束縛應激大鼠為研究對象，觀察文拉法辛對大鼠焦慮和抑郁樣行為的影響，并從腦內單胺遞質和HPA軸等角度探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

36只SPF級健康雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2013-0004]，飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級動物房[SYXK(湘)2015-0003]，實驗經動物倫理委員會批準，倫理編號：20180717。大鼠購入后適應性喂養3 d，整個實驗期間均在室溫(24±1)℃、相對濕度(50±5)%環境下，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸文拉法辛片(規格：每片75 mg，批號：L20778)購于成都康弘藥業公司；5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)、去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)、多巴胺(dopamine, DA)對照品購于中國食品藥品檢定研究院；促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮質酮(corticosterone, CORT)試劑盒購于上海晶天生物公司；蘇木精、伊紅購于上海江萊生物公司；大鼠固定架購于北京冀諾泰科技公司；高架十字迷宮購于長沙肯基科技公司；斯金納箱購于西班牙Panlab公司；RM223切片機、倒置光學顯微鏡購于德國Leica公司；高效液相色譜儀購于美國Agilent公司；電化學檢測器購于荷蘭Antec公司；酶標儀購于美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與造模

根據體質量值將36只SD大鼠隨機分成正常對照組、慢性束縛應激模型組和文法拉辛組，每組12只。對照組大鼠正常飼養，模型組和文拉法辛組大鼠均給予21 d的慢性束縛應激，具體方法為：將大鼠放入特制的長22 cm，直徑8 cm的固定架中，固定架前端有通氣孔使動物保持正常呼吸，尾端有三個孔徑的圓形門，可根據動物身長自由切換，每天固定時間為9:00～15:00，共6 h。

1.3.2 動物給藥

于造模期間灌胃給藥，文拉法辛臨床人用劑量為75 mg/d，根據體表面積比率換算，大鼠的臨床等效劑量為6.75 mg/kg，灌胃體積為10 mL/kg，每天1次，對照組和模型組大鼠則給予等體積蒸餾水。末次給藥完成后，動物進行行為學測試，測試完成后取血液和海馬組織保存。

1.3.3 行為學檢測

(一)焦慮行為檢測：① 高架十字迷宮實驗：將大鼠放入標準的高架十字迷宮正中央區域，頭朝閉臂，使動物自由探索5 min，記錄大鼠分別進入封閉臂次數(closed-arm entries, CE)和開放臂次數(open-arm entries, OE)，以及在封閉臂停留時間(closed-arm times, CT)和開放臂停留時間(open-arm times, OT)，由此計算出：(1)總穿臂次數(total entries, TE)：OE+CE；(2)進入開放臂次數的比例(OE%)：OE/(OE+CE)×100%；(3)開放臂停留時間比例(OT%)：OT/(OT+CT)×100%。② 場景恐懼測試：于測試前1 d進行訓練，大鼠在斯金納箱適應2 min后，給予30 s的噪音(5 kHz，75 dB)，在噪音結束最后2 s同時給予電擊(50 V)，繼續停留30 s。24 h后進行測試，大鼠進入斯金納箱2 min后給予60 s的噪音，記錄60 s內大鼠的僵住時間(Freezing)百分比。

(二)抑郁行為檢測：① 曠場實驗：將大鼠放入長寬高分別為80、80、40 cm的黑色敞箱中，敞箱底部均勻劃分為25個小格，測試時將大鼠置于敞箱正中央小方格中，每次均從同一方向放入，大鼠自由活動1 min后，記錄4 min內大鼠的水平運動次數和垂直站立次數。② 強迫游泳實驗：將大鼠放入高50 cm、直徑20 cm、水深約35 cm的圓柱形塑膠玻璃筒中，水溫保持在(24±1)℃，待大鼠自由游泳適應1 min后，記錄5 min內大鼠游泳不動時間。

1.3.4 組織病理形態觀察

取固定于4%多聚甲醛溶液中的海馬組織，常規石蠟包埋后切片，經脫蠟、水化后進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)后再進行脫水、透明和封片，裝盒待用。顯微鏡下觀察、拍取圖片，分析各組大鼠海馬組織的病理損傷情況。

1.3.5 HPLC-ECD檢測

采用高效液相色譜-電化學(HPLC-ECD)法檢測大鼠海馬單胺遞質含量，取海馬組織稱重，按1:10比例加入0.01 mol/L高氯酸溶液，冰上勻漿，4℃、13 000 r/min條件下離心15 min后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后待測。色譜條件為：色譜柱：Quattro 3 C18柱；流動相：磷酸二氫鈉/檸檬酸混合液—甲醇(87∶13)；流速：0.2 mL /min；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。標準曲線的制備方法為：精密稱取適量對照品溶于0.01 mol/L高氯酸溶液中，配成1 mg/mL儲備液，依次稀釋成200、100、50、25、12.5、6.25 ng/mL，根據各峰面積計算標準曲線，見表1。

1.3.6 ELISA實驗

采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血漿CRH、ACTH、CORT含量，整個過程按照ELISA試劑盒說明書進行。依次將血漿、標準品、HRP標記的檢測抗體加入到試劑盒中，37℃溫育30 min，洗滌液沖洗5次；分別加入顯色劑A、顯色劑B各50 μL，混勻，37℃避光顯色15 min，而后加入終止液50 μL以終止反應，于450 nm波長下測量各孔的吸光度值。根據標準曲線求出各組大鼠血漿待測物質的含量。

1.4 統計學方法

表1 單胺遞質對照品的回歸方程和線性范圍Table 1 Regression equations and linear ranges of three monoamine neurotransmitters

2 結果

2.1 文拉法辛對慢性束縛應激大鼠焦慮行為的影響

在高架十字迷宮實驗中，模型組大鼠較正常大鼠的TE、OE%、OT%值均明顯下降(P<0.01)；文拉法辛給藥后，大鼠TE、OE%和OT%值均顯著上升(P<0.01或P<0.05)；在場景恐懼測試中，模型組大鼠Freezing時間比顯著上升，給藥后則有較明顯的下降(P<0.05)。說明文拉法辛能改善慢性束縛應激大鼠的焦慮樣行為。見表2。

2.2 文拉法辛對慢性束縛應激大鼠抑郁行為的影響

曠場實驗和強迫游泳實驗發現，與正常大鼠比較，慢性束縛應激大鼠自主活動評分顯著下降(P<0.01)，不動時間增加(P<0.01)，展現出運動不能和行為絕望的抑郁樣特征，在文拉法辛治療后，大鼠抑郁樣行為得到明顯改善，水平和垂直得分增加(P<0.01或P<0.05)，強迫游泳不動時間下降(P<0.01)。見表3。

2.3 文拉法辛對慢性束縛應激大鼠海馬形態學的影響

如圖1所示，正常大鼠海馬神經細胞排列整齊緊密，細胞間隙正常，形態結構完整；模型組大鼠海馬神經細胞有較明顯的缺失，細胞排列紊亂，部分神經元胞體呈空泡狀，胞核深染，整體損傷明顯；文拉法辛組大鼠海馬神經元數量增多，排列趨于正常，整體損傷情況有明顯的緩解。

2.4 文拉法辛對慢性束縛應激大鼠單胺神經遞質的影響

與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中神單胺類神經遞質5-HT、NE、DA含量均顯著下降(P<0.01或P<0.05)；而在給予文拉法辛治療后，單胺神經遞質含量明顯回升(P<0.01或P<0.05)，表明文拉法辛能改善慢性束縛應激大鼠腦內單胺遞質失調狀態。見表4。

表2 各組大鼠焦慮樣行為測試結果 (n=12)Table 2 Results of anxiety-like behavior test in the rats

注：與對照組比較，**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the control group,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

表3 各組大鼠抑郁樣行為測試結果 (n=12)Table 3 Results of depressive-like behavior test in the rats

注：與對照組比較，**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01.

Note. Compared with the control group,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

表4 各組大鼠海馬單胺神經遞質含量 (ng/g，n=6)Table 4 Hippocampal monoamine neurotransmitter content in the rats

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

Note. Compared with the control group，*P<0.05,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

2.5 文拉法辛對慢性束縛應激大鼠血漿HPA軸指標的影響

與對照組相比，模型組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量均有明顯的上升(P<0.01)，HPA軸紊亂明顯；文拉法辛治療后，血漿CRH、ACTH、CORT含量均有不同程度的下降(P<0.01或P<0.05)，其中以CRH下降最為明顯(P<0.01)，表明文拉法辛能抑制慢性束縛應激大鼠HPA軸過度亢進現象。見表5。

3 討論

本研究采用21 d慢性束縛應激的方法造模，經多種行為學檢測發現，大鼠在高架十字迷宮中的開臂探索行為下降，場景恐懼中的Freezing時間比增加，同時自主活動能力下降，絕望行為增加，表現出穩定的焦慮和抑郁樣行為。該結果證明慢性應激是焦慮癥與抑郁癥的共同發病因素，慢性束縛應激可作為焦慮抑郁共病發病機制研究及藥物篩選的動物模型。

單胺假說是目前公認的抑郁癥發病關鍵機制，假說認為抑郁癥的發病與中樞神經單胺類遞質5-HT、NE、DA的耗竭緊密相關[7]。研究發現，抑郁癥的嚴重程度與體內單胺遞質的耗竭呈正相關[8]。目前臨床上主要以5-HT、NE重吸收抑制劑(SSRIs)作為抑郁類疾病治療的首選藥物，通過阻斷5-HT或NE重吸收，提升其在突觸間隙的濃度，進而有效緩解病情[9]。海馬作為腦內主要負責學習記憶及情緒行為的組織，是焦慮、抑郁等神經精神疾病研究的關鍵靶器官[10]。本研究發現，慢性束縛應激大鼠海馬組織存在神經元缺失、排列紊亂、部分胞體呈空泡狀等病理現象，單胺神經遞質含量顯著下降，均與其焦慮和抑郁樣行為相關，而在給予抗抑郁藥文拉法辛干預治療后，大鼠神經元損傷情況有所緩解，海馬組織內單胺遞質含量有明顯的升高，焦慮及抑郁樣行為均明顯改善。

HPA軸由下丘腦、垂體和腎上腺構成，是體內重要的反饋調節系統，下丘腦分泌CRH，激活垂體產生ACTH，繼而促進腎上腺皮質的組織增生及皮質激素的生成分泌，共同維持機體內環境的平衡[11]。研究表明，焦慮癥與抑郁癥患者均存在HPA軸功能亢進現象，且抑郁共患焦慮患者HPA軸亢進更為明顯[12]。長期接受慢性應激會導致HPA軸基礎活性增高，使腎上腺分泌糖皮質激素增多，透過血腦屏障進入到腦，而海馬組織又是腦內HPA軸的高位調節中樞，密集分布著糖皮質激素受體，易遭受過量糖皮質激素的攻擊而產生神經毒性，影響大腦的認知功能并加重情緒障礙[13-14]。本研究發現，慢性束縛應激大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量為正常大鼠的數倍，顯示其體內HPA軸高亢，而文拉法辛治療后能降低模型大鼠的HPA軸功能亢進狀態。

圖1 各組大鼠海馬組織的病理改變(HE染色)Figure 1 Pathological changes in hypocampal tissues of the rats

組別Groups促腎上腺皮質激素釋放激素CRH促腎上腺皮質激素ACTH皮質酮CORT對照組 Control7.85 ± 0.964.27 ± 0.6918.91 ± 3.10模型組 Model20.89 ± 4.64??9.70 ± 1.97??37.37 ± 5.81??文拉法辛組 Venlafaxine 11.79 ± 2.08?? 6.84 ± 0.91# 26.75 ± 4.72#

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

綜上，文拉法辛能改善慢性束縛應激大鼠的焦慮和抑郁樣行為，減緩海馬組織的損傷，其作用可能與上調腦內單胺神經遞質含量，抑制體內HPA軸過度亢進有關。