構建膿毒癥大鼠ICU獲得性衰弱模型的研究

唐 章，徐朝霞，李 亞，朱忠立，宋羽希，向朝雪，李福祥

危重癥患者無明確病因出現骨骼肌變性或（和）外周神經損傷，并由此產生的一系列臨床表現被稱之為ICU獲得性衰弱(ICU-AW)。研究顯示，該病的發生與膿毒癥、機械通氣、長時間制動、高血糖狀態、激素及神經肌肉阻滯劑應用等因素有關[1]。隨著重癥監護理念的發展，呼吸機的廣泛使用，ICUAW的發病率也隨之增加。然而，目前對于該病的診治仍未形成完善的臨床指南，制約該病研究的關鍵在于目前仍未有一種契合該病發病機制的實驗動物模型構建方法。本研究擬通過對膿毒癥大鼠進行制動來構建一種簡便、易行的ICU-AW大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 10 w齡、體重393～421 g健康雄性SPF級SD大鼠[成都達碩公司，生產許可證號：scxk（川）2008-24]。 脂多糖內毒素(LPS，北京索萊寶公司)，Atrogin-1引物、Murf1引物（成都擎科梓熙公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備[2]實驗大鼠72只，隨機分成 12 組（對照 3、6、9 d 組；制動 3、6、9 d 組；LPS 3、6、9 d 組；LPS 加制動 3、6、9 d 組），各 6 只。 大鼠腹腔注射4%水合氯醛(10 ml/kg)全身麻醉后稱重，LPS組和LPS+制動組一次性腹腔注射LPS 5 mg/kg，對照組和制動組腹腔注射等體積生理鹽水。隨后將制動組和LPS+制動組大鼠持續固定于大鼠固定器制動至各分組時間點。對照組和LPS組置于鼠籠內，各實驗鼠僅每天喂服葡萄糖氯化鈉溶液(5 ml/kg·h)，置于動物房，保持室溫24～30℃左右，24 h通風排氣。

1.2.2 標本制備 分別于分組后3、6、9 d處死各組相應時間點大鼠，再次稱重。留取大鼠膈肌和雙側腓腸肌，將所取標本一部分放入10%甲醛中24 h以上，剩余部分標本放置于-80℃冰箱。

1.2.3 觀察指標 組織形態學觀察：取上述經甲醛固定的膈肌、腓腸肌組織標本，浸蠟包埋，以厚度4 mm切片，脫蠟、至水、蘇木素染色5 min；自來水沖洗，鹽酸乙醇溶液分化30 s，于伊紅溶液中2 min；脫水、透明、封片。每個標本于200倍光鏡下至少觀察5個切片，采用IPP6.0圖像分析軟件測定肌纖維橫徑，每張切片測5個視野，取平均值。

RT-PCR法檢測Atrogin-1和Murf1基因表達量：將研缽放置于冰上預冷，從-80℃冰箱中分別取出l00 mg腓腸肌和膈肌標本，放入研缽內，加入液氮反復磨細，加入1 ml Trizol充分勻漿，分別將腓腸肌和膈肌轉移至0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理后的EP管內，加入 0.2 ml氯仿，劇烈振蕩 15 s，12 000 r/min，離心（4℃）15 min，取上清液；加入異丙醇 0.5 ml，充分混勻，于室溫 10 min，12 000 r/min，離心（4℃）10 min；棄上清液，加入1 ml 75%乙醇，洗滌沉淀，7500 r/min，離心（4 ℃）10 min；棄上清液，晾干，加入適量的DEPC H2O溶解。按照Akkad等[3]的基因序列設計引物，由成都擎科梓熙公司合成該引物，引物系列 ：Atrogin-1:5'-TCCTGGATCCAGAAGATTCA AC-3'(上 游)，5'-TCAGGGATGTGAGCTGTGACTT-3'(下游);Murf1:5'-ACCACCTCTGCCGGAAGTGT-3'(上游)，5'-CCGCGGTTGGTCCAGTAG-3'(下游)。 兩步法PCR擴增測量Atrogin-1和Murf1基因表達量。

1.3 統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析，符合正態分布計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間點體重比較 在各分組時間點，LPS+制動組體重均明顯低于其他3組（P＜0.05，表 1）。

表1 各組間不同時間點體重比較（n=6）

2.2 各組腓腸肌和膈肌組織形態學比較 在各分組時間點，LPS+制動組腓腸肌和膈肌纖維較其他各組明顯萎縮，且伴有纖維間隔不同程度增寬（圖1）。

圖1 各組腓腸肌形態學結構（HE染色，×200）

2.3 各組腓腸肌和膈肌纖維橫徑比較 對照組各時間點腓腸肌和膈肌纖維橫徑比較無顯著差異（P＞0.05），而其他3組均隨時間延長而逐漸減小；在各分組時間點，LPS+制動組腓腸肌、膈肌纖維橫徑均明顯小于其他3組（P＜0.05，表2）。

2.4 各組腓腸肌和膈肌Atrogin-1和Murf1 mRNA相對表達量比較 在各分組時間點，LPS+制動組腓腸肌、膈肌Atrogin-1、Murf1 mRNA相對表達量均明顯高于其他 3組（P＜0.05）。 見表 3、4。

圖2 各組膈肌形態學結構（HE染色，×200）

表2 各組腓腸肌和膈肌纖維橫徑比較（n=6）

表3 各組腓腸肌Atrogin-1mRNA和Murf1?mRNA相對表達量比較（n=6）

表4 各組膈肌Atrogin-1mRNA和Murf1?mRNA相對表達量比較（n=6）

3 討論

ICU-AW可分為多發性肌病、多發性神經病及多發性神經肌病3種亞型[4]，而臨床常見為多發性肌病，因此，大多數研究均以該亞型建模。常用的建模方法有膿毒癥法、懸吊法、機械通氣法、激素誘導法等，但每種方法均存在不同缺點，故上述方法均未得到普及[5]。文獻顯示，膿毒癥不僅會導致實質器官功能衰竭，還可以造成周圍神經和骨骼肌損傷[6]。此外，制動（特別是長時間制動）是導致ICU-AW的另一重要原因[7]。因此，本研究在既往基礎上，兼顧可行性和臨床發病特征，采用LPS加制動建模。

病理檢查發現肌纖維萎縮和神經軸突變性仍是目前確診本病的標準，但上述改變在發病早期并不明顯。而研究顯示，Murfl和Atrogin-1作為泛素-蛋白酶體途徑中兩個重要的特異性肌肉萎縮指標，參與了泛素化過程[8]；由各種疾病所致骨骼肌萎縮中，都可以觀察到它們的特異性表達，故將其作為ICU-AW動物建模的早期觀察指標[9]。

本研究結果提示，LPS+制動組大鼠相比較其他各組大鼠體重明顯下降，腓腸肌和膈肌纖維橫徑明顯減小，且隨著實驗時間的延長，這一效應越顯著，說明LPS+制動組大鼠較其他組大鼠發生了骨骼肌萎縮。另外，在制動組大鼠中，腓腸肌纖維橫徑較對照組和LPS組明顯下降，說明制動在肢體肌肉萎縮上發揮著重要的作用，這可能是廢用性肌萎縮改變所致。而LPS組大鼠膈肌纖維橫徑較對照組和制動組明顯下降，說明膿毒癥狀態對膈肌萎縮也有一定影響，但其機制有待進一步研究。在Atrogin-1、Murf1基因表達上，LPS+制動組大鼠較其他各組顯著增強。不僅如此，還發現Atrogin-1、Murf1基因表達是發生在建模的早期階段，并隨著實驗時間延長，表達量增多，說明泛素-蛋白酶體途徑參與了多發性肌病的發病過程，且其特異性標記物的產生是先于形態學改變的，那么是否可以將此類標記物用于多發性肌病的早期診斷，仍需實驗驗證。

綜上所述，腹腔注射LPS加制動可作為構建ICU獲得性衰弱大鼠模型的方法，且該方法簡便、易行，同時符合ICU-AW發病機理，可用于ICU-AW發病機理、治療等的實驗研究。