20%烯?戊?惡種衣劑研制及對大豆鐮孢根腐病的防效

王奧霖 譚兆巖 王對平

摘要 為研制一種防治大豆鐮孢根腐病的高效、低毒種衣劑，采用菌絲生長速率法測定了96%烯效唑（uniconazole）原藥、97%戊唑醇（tebuconazole）原藥、98%惡霉靈（hymexazol）原藥對引起大豆根腐病的禾谷鐮孢、尖鐮孢和腐皮鐮孢的毒力，篩選最佳復配配比。利用濕研磨法制備種衣劑，并進行室內盆栽苗驗證。結果表明：烯效唑、戊唑醇和惡霉靈的配比為3∶1∶16時，對供試3種鐮孢菌均表現為增效作用。室內盆栽苗驗證試驗結果表明，播種前，采用20%烯·戊·惡懸浮種衣劑1.0～2.0 g/kg處理大豆種子對大豆發芽和出苗沒有顯著影響，并可降低株高，且各濃度處理對大豆尖鐮孢和腐皮鐮孢根腐病的相對防效均達83.3%以上，對尖鐮孢根腐的防效高于5%戊唑醇懸浮種衣劑，對腐皮鐮孢和禾谷鐮孢根腐病與5%戊唑醇懸浮種衣劑防效相當。本研究開發的20%烯·戊·惡懸浮種衣劑為進一步開展大豆根腐病田間化學防治及推廣應用奠定了基礎。

關鍵詞 大豆根腐病; 鐮孢菌; 復配; 種衣劑; 毒力測定

中圖分類號： S 482.2

文獻標識碼： BDOI： 10.16688/j.zwbh.2018227

Abstract In order to screen one seed coating agent with high efficacy and low toxicity for controlling Fusarium root rot of soybean， the virulence of uniconazole 96% TC， tebuconazole 97% TC， hymexazol 98% TC， and the mixture compounds on F.graminearum， F.oxysporum and F.solani causing soybean root rot were tested using the method of hyphal growth rate. The optimal proportion of the mixture of uniconazole， tebuconazole， hymexazol was screened out. Furthermore， the seed coating agent was prepared， and the control efficacy was determined by soybean seedling inoculation in laboratory. The results showed the synergistic effect of the mixture of uniconazole， tebuconazole， and hymexazol at the proportion of 3∶1∶16 was the best for all three Fusarium species. After treatment with 1.0-2.0 g/kg of uniconazole·tebuconazole·hymexazol 20% FSC， germination rate and emergency of soybean were not affected， while plant height decreased， and the control efficacy on root rot infected by F.oxysporum and F.solani reached 83.3%， which was better than that of the commercial tebuconazole 5% FSC. There was no significant difference between the two seed coating agents on root rot infected by F.graminearum. This study provides a valuable information for field application of uniconazole·tebuconazole·hymexazol 20% FSC and for effective control of Fusarium root rot of soybean.

Key words soybean root rot; Fusarium; mixture compound; seed coating agent; toxicity test

大豆根腐病是大豆生產中的重要土傳真菌病害，該病在我國各大豆產區普遍發生，具有發病嚴重、防治困難等特點[1]。據報道，鐮孢菌是大豆根腐病的主要致病菌，尤以尖鐮孢Fusarium oxysporum和腐皮鐮孢F.solani為主，此外，其他多種鐮孢菌如禾谷鐮孢F.graminearum、木賊鐮孢F.equiseti、層生鐮孢F.proliferatum等也可引起大豆根腐病[23]。鐮孢菌寄主范圍廣，可危害小麥、玉米、大豆、煙草等多種作物，且在田間病殘體、土壤表面或內部均可長期存活，導致鐮孢菌引起的大豆根腐病一旦發生，很難防治[45]。近年來，隨著國家產業結構調整，玉米大豆帶狀復合種植模式在西南、西北地區種植面積逐年增加，經濟、社會和生態效益顯著。然而，受玉米蔭蔽作用，寡照多雨的氣候條件，以及秸稈還田、免耕或淺耕等保護性栽培措施的影響，套作大豆苗期根腐病發生嚴重。課題組前期調查發現，套作大豆根腐病普遍發生率達10%～75%，嚴重影響大豆產量[6]。

種子包衣是防治大豆根腐病的一種有效措施，其中化學復配種衣劑具有成本低、效率高、藥效長、使用方便等特點，且能夠有效延緩或避免病原菌抗藥性的產生，廣泛應用于作物種子處理[78]。Weems等[9]分別采用咯菌腈、精甲霜靈、嘧菌酯、甲霜靈、甲基硫菌靈等化學藥劑的復配組合處理種子，結果表明各復配組合均可在一定程度上控制大豆猝死綜合征（sudden death syndrome，SDS）。張榮芳等[10]采用35%多·?！た舜蠖钩⒎鄯N衣劑拌種，結果顯示，該復配劑對大豆根腐病的防效達76.9%以上。劉秀林等[11]利用市場上常用的625 g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑（亮盾）和70%噻蟲嗪種子處理可分散粉劑（銳勝）處理大豆種子，結果表明其出苗率、單株鮮重、株高和產量均有顯著提高。目前生產上可用于大豆根腐病的種衣劑種類仍較少，有必要研制更多類型的種衣劑，為大豆地下病蟲害防治提供保障。

烯效唑（uniconazole）是一種三唑類植物生長調節劑，具有高效、低毒、低殘留、降解快等特點，對促進植物矮健、抗倒伏、防衰老等具有明顯效果，兼具殺菌、除草作用。研究表明，烯效唑干拌種能改善套作大豆苗期生長狀況，提高大豆耐陰抗逆能力[12]。戊唑醇（tebuconazole）屬三唑類殺菌劑，具有高效、低毒、低殘留、持效性強、內吸性強等特點，可用于作物的種子處理或葉面噴灑，已用于大麥、小麥黑穗病、紋枯病及種傳輪斑病的防治[1315]。惡霉靈是一種優良的土壤消毒劑，可高效抑制土壤中腐霉菌、鐮孢菌的孢子萌發，且對有益細菌、放線菌的影響較小。目前尚無烯效唑、戊唑醇和惡霉靈復配組合對大豆根腐病鐮孢菌的毒力測試以及種衣劑研究。本研究測定烯效唑、戊唑醇和惡霉靈單劑及其復配組合對大豆根腐病鐮孢菌的毒力，篩選對大豆鐮孢根腐病具有較好防效的復配配方并制備種衣劑，為有效防治大豆根腐病提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株及植物

供試菌種為大豆根腐病鐮孢菌，包括尖鐮孢F.oxysporum、禾谷鐮孢F.graminearum和腐皮鐮孢F.solani，均由本實驗室分離自大豆根腐病病樣，經形態學和分子鑒定，4℃保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體斜面培養基中，備用。室內盆栽藥劑試驗用大豆品種為‘南豆12，由本實驗室留種備用。

1.1.2 供試藥品及試劑

毒力測試及復配藥劑：96%烯效唑（uniconazole）原藥，上海源葉生物科技有限公司;97%戊唑醇（tebuconazole）原藥，鄭州瑞凱農化工產品有限公司;98%惡霉靈（hymexazol）原藥，湖北貓爾沃生物醫藥有限公司。

種衣劑制備試劑：潤濕劑為十二烷基硫酸鈉，美星化工產品有限公司;潤濕分散劑為農乳602#（苯乙基酚聚氧乙烯醚），邢臺市藍天精細化工有限公司;成膜劑為聚乙烯醇（PVA），上海源葉生物科技有限公司;增稠劑為黃原膠酸，鄭州亨多寶化工有限公司;消泡劑為正辛醇，科龍化工有限公司;色素為羅丹明B，上海源葉生物科技有限公司。pH調節劑磷酸二氫鉀、鹽酸、氫氧化鉀等購自成都溫江瑞進特生化有限公司。

室內盆栽苗試驗：5%戊唑醇懸浮種衣劑，江蘇張家港七洲化工有限公司。盆栽植物營養土（成分為泥炭營養土、蛭石和珍珠巖，pH 6.5），購自成都溫江瑞金特生化有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內藥劑毒力測定

采用菌絲生長速率法[16]。將3種原藥分別配制成5個不同濃度，經過濾滅菌后，加入已滅菌的馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）中，并添加3%（m/V）鏈霉素，充分混勻后，制備成PDA平板（d=9 cm）。取PDA平板上生長5 d的各鐮孢菌菌株，采用打孔器從菌落邊緣制備菌餅（d=5 mm），將菌餅接入添加不同藥劑的PDA平板上，每板1個菌餅，（25±3）℃黑暗培養5 d。每種藥劑每濃度均設置3個PDA平板，以未加入任何藥劑的接菌平板作為對照，試驗重復3次。待菌生長5 d后，采用“十字交叉法”測量菌落生長直徑，計算不同藥劑對各鐮孢菌的菌絲生長抑制率（%）。

1.2.2 復配藥劑聯合效果評價

1.2.2.1 烯效唑與戊唑醇復配

將烯效唑和戊唑醇原藥按有效成分配制成1∶1、1∶3、1∶5、3∶1、3∶5，共5個配比，分別進行毒力測定。參照陳軍等[17]的方法，以各單劑的EC50、不同配比處理的 EC50和配比系數為基礎，通過計算各藥劑的毒力指數（TI）、混劑的實際毒力指數（ATI）、混劑的理論毒力指數（TTI）和共毒系數（CTC）評價混劑聯合作用類型。選取其中的A藥劑為標準藥劑，各藥劑毒力指數按以下公式計算：

1.2.2.2 烯效唑、戊唑醇與惡霉靈復配

以1.2.2.1獲得的對3種鐮孢菌均表現增效的烯效唑和戊唑醇的配比為基礎，與惡霉靈進一步復配，按有效成分質量比制成3∶1∶4、3∶1∶8、3∶1∶16、3∶1∶20、3∶1∶40共5個配比進行毒力測定，計算共毒系數，并評價混劑聯合作用類型，篩選獲得復配混劑的最佳配比。

1.3 烯效唑、戊唑醇與惡霉靈種衣劑制備

20%烯·戊·惡懸浮種衣劑包括活性成分和助劑，其中活性成分的配比為3∶1∶16。助劑包括潤濕劑十二烷基硫酸鈉0.1%～2%（質量分數，下同）、乳化分散劑農乳602# 4%、 成膜劑聚乙烯醇4%、 增稠劑黃原膠酸0.2%，防凍劑乙二醇2%、 消泡劑正辛醇2%，色素羅丹明B 0.5%，其余由水補足至100%。先按比例稱取各組分成分，在成膜劑聚乙烯醇中加入1/2種衣劑體積的蒸餾水，在80℃水浴鍋中持續加熱，并不斷攪拌，使其完全溶解，熬制成均一、透明、無不溶物的膠狀物，備用。隨后將其他組成成分按質量分數進行混合，余量用水補足，加入已制備好的成膜劑溶液一起放入膠體磨中進行初步研磨20 min，再使用多功能研磨攪拌機研磨30 min，然后采用高速乳化剪切機以7 000～10 000 r/min高速攪拌、剪切、調勻、分散10 min，制備成穩定的混合劑，制得20%烯·戊·惡懸浮種衣劑。

1.4 室內藥效測定

1.4.1 種衣劑安全性檢測

設置20%烯·戊·惡懸浮種衣劑藥種比為0.2、0.6、1.0、2.0、4.0、8.0 g/kg，以5%戊唑醇懸浮種衣劑推薦用量4 g/kg為陽性對照，以清水處理為陰性對照，共8個處理。將大豆種子按照各處理用量拌種后，播種于裝有植物營養土（泥炭營養土、蛭石和珍珠巖，pH 6.5）的直徑15 cm花盆中，每盆10粒，每處理6盆，重復3次。播種后的花盆置于人工氣候箱中25℃，85% RH，L∥D=16 h∥8 h，分別于第5天統計發芽率和芽長，于第20天時統計出苗率、株高、地上部鮮重和根鮮重。

1.4.2 種衣劑室內防效檢測

參照張麗等[2]的高粱粒接種法對大豆進行接種，檢測種衣劑對大豆根腐病的室內防效。將高粱粒煮熟后裝入250 mL錐形瓶內，121℃，滅菌30 min，重復1次，待其冷卻后，分別接入10個PDA培養7 d的病原菌菌餅，25℃黑暗條件下培養20 d，待高粱粒表面長滿菌絲體用于接種。在直徑15 cm的花盆中裝入1/3體積的滅菌培養基質，均勻撒入2 cm厚的帶菌高粱粒，蓋上一層培養基質，然后采用1.4.1中篩選獲得的對大豆種子和生長安全的4個種衣劑用量處理大豆種子，以5%戊唑醇懸浮種衣劑藥種比4 g/kg為陽性對照，以清水為空白對照（CK）。取處理后的種子7粒播種于培養基質中，將花盆放置于人工氣候室，25℃，85% RH，L∥D=16 h∥8 h。每個處理3次重復，每個重復3個花盆。于播種后20 d調查出苗率及發病情況。大豆根腐病的分級標準參照馬淑梅[18]的方法，依據病害分級標準計算病情指數與種衣劑對根腐病的防效。

病情指數=∑（各級病株數×相對病級數值）調查株數×5×100;

根腐病防效=對照病情指數-處理病情指數對照病情指數×100%。

1.5 數據分析

采用SPSS 17.0軟件中ANOVA 方法對田間試驗各項數據均值進行單因素方差分析，分析比較其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 3種單劑對鐮孢菌的室內毒力測定結果

由表1可知，戊唑醇、烯效唑、惡霉靈對3種大豆根腐病致病鐮孢菌均具有抑制作用，其中，戊唑醇對禾谷鐮孢、腐皮鐮孢和尖鐮孢的EC50分別為0.78、0.82和0.32 μg/mL，綜合表現最好。烯效唑對禾谷鐮孢的抑菌效果最好，EC50為0.49 μg/mL。惡霉靈對尖鐮孢和禾谷鐮孢的抑菌效果較好，但對腐皮鐮孢的EC50為322.12 μg/mL。

2.2 烯效唑、戊唑醇與惡霉靈不同復配組合對鐮孢菌的聯合作用效果

以烯效唑與戊唑醇的不同配比對3種鐮孢菌進行毒力測定，由表2可知，烯效唑與戊唑醇的配比為3∶1，對腐皮鐮孢和尖鐮孢表現為增效，共毒系數分別為137.93和833.33，與其他配比相比，綜合表現最好。在此基礎上，測定烯效唑、戊唑醇與惡霉靈不同配比對3種鐮孢菌的毒力，如表3所示，當3種藥劑配比為3∶1∶16和3∶1∶20時對3種鐮孢菌均表現為增效作用?？紤]節約成本，以烯效唑、戊唑醇和惡霉靈的復配配比3∶1∶16用于制備懸浮種衣劑。

2.3 20%烯·戊·惡懸浮種衣劑對盆栽苗的安全性及對大豆鐮孢根腐病的防效

如表4所示，播種5 d后，6種不同用量20%烯·戊·惡懸浮種衣劑處理后的大豆發芽率與清水對照相比差異不顯著，低用量處理可在一定程度上促進大豆發芽，而5%戊唑醇懸浮種衣劑處理顯著抑制大豆發芽。播種20 d后，與對照相比，不同用量種衣劑處理可促進大豆出苗，但差異不顯著，與5%戊唑醇懸浮種衣劑處理相比，低用量種衣劑可顯著提高大豆出苗;不同用量種衣劑處理后大豆根鮮重無明顯增加，5%戊唑醇懸浮種衣劑處理后根鮮重顯著降低;同時，不同用量20%烯·戊·惡懸浮種衣劑處理均能顯著抑制株高和下胚軸長，高濃度抑制效果更明顯，但與5%戊唑醇懸浮種衣劑相比大豆株高差異不顯著。綜上所述，與對照相比，低用量20%烯·戊·惡懸浮種衣劑（0.2～1.0 g/kg）處理對大豆各生長指標影響不明顯，且能夠在一定程度上促進大豆發芽和出苗，降低株高，安全性高。

采用高粱粒接種法接種后，檢測各用量20%烯·戊·惡懸浮種衣劑對大豆根腐病三種致病鐮孢菌的防治效果，由表5可知，與清水對照處理相比，使用20%烯·戊·惡懸浮種衣劑包衣0.2～2.0 g/kg處理后，3種致病鐮孢菌引起的大豆根腐病的發病率和病情指數均明顯降低，且高濃度種衣劑處理降低幅度更大。與5%戊唑醇懸浮種衣劑處理相比，20%烯·戊·惡懸浮種衣劑0.6 g/kg處理對禾谷鐮孢根腐病相對防效低于5%戊唑醇懸浮種衣劑，低濃度處理防效較低;對腐皮鐮孢根腐病相對防效，20%烯·戊·惡懸浮種衣劑0.6～2.0 g/kg處理與5%戊唑醇懸浮種衣劑相當;20%烯·戊·惡懸浮種衣劑0.2～0.6 g/kg處理對尖鐮孢根腐病的防效與5%戊唑醇懸浮種衣劑差異不顯著，高濃度則防效更好。綜合考慮，20%烯·戊·惡懸浮種衣劑1.0～2.0 g/kg處理對3種鐮孢菌接種后的根腐病的防效更好，優于5%戊唑醇懸浮種衣劑。

3 結論與討論

本研究選取烯效唑、戊唑醇和惡霉靈3種生產上常用的種衣劑及殺菌劑，測定了不同復配組合對大豆根腐病主要致病菌尖鐮孢、腐皮鐮孢和禾谷鐮孢的毒力，篩選獲得了最佳復配配比，并制備了20%烯·戊·惡懸浮種衣劑，進一步通過室內盆栽試驗，測定了該種衣劑對大豆的安全性，以及對3種鐮孢菌接種后大豆根腐病的防效，結果顯示，烯效唑、戊唑醇和惡霉靈的配比為3∶1∶16增效作用明顯，采用20%烯效唑·戊唑醇·惡懸浮種衣劑1.0～2.0 g/kg處理大豆種子對大豆尖鐮孢和腐皮鐮孢菌根腐病的相對防效達83.3%以上，高于市面上常見的5%戊唑醇懸浮種衣劑。

研究表明，戊唑醇、烯效唑對大豆根腐病3種主要致病鐮孢菌均有很強的抑制作用，可以取代曾經長期大范圍使用的多菌靈等常規單劑，延緩病菌抗藥性的產生。戊唑醇是具有內吸性的三唑類殺菌劑，周子燕等[21]研究表明三唑類殺菌劑能顯著調節植物生長，改善植物體內激素平衡，增強植物逆境生長能力。畢彥博等[22]發現三唑類殺菌劑可促進植物光合作用，增加酶類與非酶類抗氧化劑含量，降低丙二醛含量，從而有效緩解植物逆境脅迫壓力，保持細胞質膜的穩定性及抗氧化。烯效唑是日本住友公司推出的植物生長調節劑[23]，多用于矮化壯苗。雍太文等[24]研究發現，烯效唑干拌種可顯著提高大豆單株籽粒、蛋白質和粗脂肪產量，在苗期適度干旱脅迫下烯效唑干拌種能顯著降低大豆株高、縮短第1節間長度，增加莖粗和倒3葉葉面積，提高了大豆產量，提升了大豆品質。于虹漫等[25]研究指出，烯效唑處理可提高秧苗體內的SOD、多酚氧化酶（PPO）及苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，提高水稻對鐮孢菌和立枯絲核菌復合侵染引起的立枯病的抗性。本試驗結果表明，烯效唑對3種大豆根腐病致病鐮孢菌抑菌活性均較強，尤其是對禾谷鐮孢抑制作用顯著，可能與禾谷鐮孢對烯效唑更敏感有關，因此烯效唑在對大豆生產方面兼有調節植物生長和殺菌作用。前人研究發現，惡霉靈毒性顯著低于其他同質藥劑，可以被土壤微生物分解成水和二氧化碳，符合綠色生產的要求被逐漸使用于復配拌種劑[26]，同時，惡霉靈進入土壤后能被土壤吸收并與土壤中的無機金屬鹽如鐵、鋁離子相互作用，能有效地抑制病原菌孢子的萌發和菌絲的生長，起到土壤殺菌、土壤消毒的效果，還可促進植物生長、根的分蘗、根毛增長、提高根部活性、提高苗的發展勢能，達到健苗、壯苗作用[26]。在本試驗中，室內毒力測定惡霉靈和戊唑醇對3種鐮孢菌EC50差異較大，可能與3種鐮孢菌對兩種殺菌劑的敏感性不同有關，對于致病性最強的尖鐮孢，惡霉靈有較好的抑制作用，雖然較前兩種藥劑對3種鐮孢菌的EC50均偏大，但考慮其進入土壤后能夠顯著增強藥效并可以防治除大豆根腐病主要致病鐮孢菌以外的土傳真菌，起到土壤清潔的作用，故在后期種衣劑的研制上以惡霉靈為主要成分。基于以上原因并聯系生產實際，本試驗選擇惡霉靈與烯效唑與戊唑醇進行三元復配。

市售5%戊唑醇懸浮種衣劑雖被廣泛運用于防治大豆鐮孢根腐病，但隨著應用范圍的擴大，使用頻率、用量、面積的增加，可能會導致抗藥性的產生，并且已有報道，室內紫外線誘導可使禾谷鐮孢對戊唑醇產生抗藥性[27]?；谀壳吧a上尚未有烯效唑、戊唑醇、惡霉靈三元復配的產品配方，田間也未發現這3種藥劑混用所造成的交互抗性，因此在目前抗病品種缺乏的情況下，為了延緩或克服病原菌抗藥性的形成和發展，采用烯效唑、戊唑醇、惡霉靈三者3∶1∶16的復配組合，研制20%烯·戊·惡懸浮種衣劑。在本配方中，以惡霉靈為主要成分的種衣劑綠色環保，而且低毒安全，對于人畜及傳粉昆蟲安全性較高，在田間預期效果上，戊唑醇與烯效唑能夠兼顧防病與提高植株自身生理性狀，增強抗逆性，為大豆穩定高產提供支撐。

本試驗通過室內盆栽苗試驗對前期鑒定的引起大豆根腐病的3種優勢致病鐮孢菌進行了單獨接種，以驗證種衣劑的防效，未模擬田間多種鐮孢菌復合侵染以及其他大豆根腐病致病菌如立枯絲核菌Rhizoctonia solani、腐霉菌Pythium sp.、疫霉菌Phytophthora sojae等[19]混合接種驗證，因此，未來將進一步開展多種鐮孢菌及其他非鐮孢菌致病菌混合接種的室內盆栽苗接種試驗，并進行田間試驗，進一步明確該種衣劑的應用效果，擴大其應用范圍。此外，在本懸浮種衣劑的制備過程中，對于該懸浮種衣劑的懸浮率、黏度、成膜時間、包衣均勻度、包衣脫落率、熱貯穩定性及低溫穩定性進行深入研究，以提高藥效的穩定性和田間應用的可行性，使其擁有更為廣泛的應用前景。

大豆根腐病是生產上需要常防常治的病害，防治便離不開化學防治，種子包衣技術是針對一系列土傳病害的有效措施，具有較好的應用前景。建議對高穩定性種衣劑進行深入的開發研究。今后在大豆根腐病的復配藥劑組合上應充分考慮治病兼治蟲的策略，控制土壤害蟲對大豆苗期根莖的鉆蛀為害以及防止由于根系受損為病原菌入侵提供有利條件。此外，除化學防治措施之外，還需從選用抗病品種、農藝措施等多方面做好預防工作。始終秉承預防為主，綜合防治的植保方針才能取得良好的防治效果。

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（責任編輯：楊明麗）