警惕種子傳帶的南方番茄病毒Southern tomato virus對我國番茄產(chǎn)業(yè)的危害

董云浩 雷喜紅 李云龍

摘要 南方番茄病毒Southern tomato virus （STV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種侵染番茄的病毒，通常與多種病毒復(fù)合侵染，可能與番茄的褪綠、黃化、衰退、果實(shí)變小等癥狀相關(guān)。該病毒最早在1984年發(fā)現(xiàn)，并于2005年命名。我國首先于2015年在山東壽光發(fā)現(xiàn)。最近，我們在山東和北京市多地的番茄樣品中均檢測到了該病毒，并通過檢測發(fā)現(xiàn)國內(nèi)一些主要品種番茄種子的STV攜帶率達(dá)40%。STV基因組為一條雙鏈RNA，隸屬Amalgaviridae科Amalgavirus屬，是嚴(yán)格種傳病毒，不能通過汁液摩擦接種和嫁接傳播。鑒于STV的潛在危害以及與其他病毒高度復(fù)合侵染造成的嚴(yán)重?fù)p失，本文介紹了STV檢測方法，并提出應(yīng)開展對主栽品種的種子檢測和針對性防控。

關(guān)鍵詞 南方番茄病毒; 復(fù)合侵染; 種子傳播; 防治措施; 種子檢測

中圖分類號(hào)： S 432.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： BDOI： 10.16688/j.zwbh.2018427

Abstract Southern tomato virus （STV） is a recently identified virus infecting tomato， which normally occurs together with a variety of viruses， and may cause chlorosis， yellowing， decline and small fruit. STV was discovered in 1984 and was named in 2005. In China， STV was firstly reported in Shouguang， Shandong province in 2015. We detected STV in tomato samples of Shandong and Beijing， and our work showed that the incidence of STV in seeds of main cultivars reached 40%. Being a member of Amalgavirus in Amalgaviridae， the STV genome is a doublestranded RNA. As a rigorous seedborne virus， STV cannot be transmitted by mechanical inoculation or grafting. In view of its potential damages and the severe losses induced by high degree of complex infection with other viruses， we introduced the detection method for STV， and recommended that seeds detection and targeted control measures should be carried out.

Key words Southern tomato virus; coinfection; seedborne; control measures; detection of seed

近年在我國一些番茄重要生產(chǎn)區(qū)（山東壽光，北京房山、昌平等地）的番茄植株上發(fā)生一種頂端葉片黃化、植株長勢逐漸衰弱、后期逐漸白化直至枯死的病害（圖1）。棚室內(nèi)病株發(fā)生率30%～100%，特別是無土栽培和基質(zhì)栽培的棚室內(nèi)，發(fā)生率超過50%，嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)。起初認(rèn)為是缺素癥，但在常規(guī)土壤栽培中也高比例發(fā)生;有專家表示在營養(yǎng)液中添加游離狀態(tài)的鐵離子一定程度上減輕了病害癥狀，但不能痊愈。

為探討是否有病毒參與這一病害的發(fā)生，我們利用深度測序鑒定病毒的方法，對北京房山和昌平的番茄樣品分別進(jìn)行了病毒病原檢測，發(fā)現(xiàn)2份樣品中均有南方番茄病毒Southern tomato virus（STV），說明STV與這一病害有相關(guān)性。為調(diào)查STV的發(fā)生，在京郊4個(gè)區(qū)縣采集番茄樣品32份進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測，在11份樣品中檢測到了STV，檢出率為34.4%;在山東壽光采集54份番茄樣品，檢測到10份樣品為STV陽性，檢出率為18.5%。目前研究表明STV僅通過種子垂直傳播。為調(diào)查國內(nèi)番茄種子攜帶STV情況，對銷量最高的10家網(wǎng)店的20份番茄種子進(jìn)行STV檢測。催芽后混樣檢測發(fā)現(xiàn)8份種子攜帶STV，對8份帶毒種子進(jìn)行單粒檢測，帶毒率為20%～75%。這些數(shù)據(jù)表明STV已在我國一些番茄主栽品種上普遍發(fā)生，應(yīng)引起注意。

1 STV的發(fā)現(xiàn)

1984年美國加利福尼亞州因皮里爾河谷的番茄出現(xiàn)黃化、衰退和坐果少等病毒病癥狀，但未分離到病原物，并且無法通過嫁接傳播到健康植株，在病株體內(nèi)可分離到3.5 kb的雙鏈RNA （ds RNA）[1]。2005年，在墨西哥西南部和密西西比東北部的番茄中出現(xiàn)了生長點(diǎn)矮化、果實(shí)變小和變色等癥狀，成熟植株常表現(xiàn)出葉脈間失綠[23]，兩地的病株中都分離出了3.5 kb的dsRNA。推測這3個(gè)地方的番茄被同一種新病毒所感染，命名為南方番茄病毒（STV）[4]。

2 分布情況

已在多個(gè)國家有報(bào)道STV的發(fā)生，包括北美洲的墨西哥和美國[5]，歐洲的法國[6]和西班牙[7]，亞洲的中國[8]和孟加拉國[9]。

我國首先在山東壽光的溫室番茄上發(fā)現(xiàn)STV[8]，隨后在新疆的加工番茄上也檢測到[10]。我們在北京市房山區(qū)、昌平區(qū)、通州區(qū)、順義區(qū)采集的番茄樣品中檢測到STV。

3 與其他病毒復(fù)合侵染導(dǎo)致嚴(yán)重危害

STV單獨(dú)侵染對番茄的致病癥狀尚不明確，但STV與番茄的褪綠、黃化、衰退、果實(shí)變小等癥狀相關(guān)[4]，雖然尚未證實(shí)其直接相關(guān)性。STV通常與其他病毒混合感染。在法國，STV與煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus （TMV）和馬鈴薯Y病毒Potato virus Y （PVY）復(fù)合侵染[6]。在西班牙發(fā)現(xiàn)，STV與人參果花葉病毒Pepino mosaic virus （PepMV），番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt virus （TSWV）和番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）共同感染[7]。孟加拉國的番茄樣品中還鑒定到PVY和黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus （CMV）[9]。山東壽光番茄樣品中檢測到STV與TYLCV、CMV、番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）[8]混合感染;在新疆番茄樣品中同時(shí)檢測到STV、CMV、PVY及番茄花葉病毒Tomato mosaic virus （ToMV）[10]。我們在北京房山檢測到STV與TYLCV、ToCV復(fù)合侵染。

4 分類和基因組

STV基因組為一條雙鏈RNA（doublestranded RNA， dsRNA），長約3.5 kb，編碼2個(gè)重疊的開放閱讀框（ORF）[5]。ORF1長1 134 nt，編碼377個(gè)氨基酸（amino acid，aa），推測為外殼蛋白（coat protein，CP），分子量為 42.4 kD （p42）;ORF2長2 289 nt，編碼762 個(gè)氨基酸的依賴于RNA的 RNA 聚合酶（RNAdependent RNApolymerase，RdRp），分子量為 87.4 kD （p87）[5]。基于其dsRNA基因組和基因組結(jié)構(gòu)模式，STV被歸類為Amalgaviridae科Amalgavirus屬[5]。

目前NCBI數(shù)據(jù)庫收錄了13條STV基因組全序列，比對發(fā)現(xiàn)從中國（KT438549）、墨西哥（EF442780）、美國（EU413670）、法國（KC333078）、孟加拉國（KT634055）鑒定的STV分離株具有99%的核苷酸序列相似性。這些STV不同分離物之間高度序列保守性說明它們可能來自同一源頭，即帶毒的番茄種子。

5 傳播方式和寄主范圍

STV是嚴(yán)格種傳病毒，不能通過汁液摩擦接種和嫁接傳播[10]，尚未發(fā)現(xiàn)有昆蟲介體傳播。STV通過品種引進(jìn)、品種培養(yǎng)和良種繁育等過程傳播[11]。因此，建立快速、準(zhǔn)確的病毒檢測方法是STV病害監(jiān)控和防治的關(guān)鍵。

目前僅在一些品種的番茄上檢測到STV。在藍(lán)莓和杜鵑花上檢測到了與STV相似的dsRNA病毒[4，1215]，引起藍(lán)莓落果，在杜鵑花上不引起明顯的癥狀。

6 檢測方法

為檢測番茄種子或番茄苗是否被STV侵染，參考使用如下方法[5]：將1粒或4～5粒番茄種子、或取番茄苗一片葉片在液氮中充分研磨。利用TRIzol試劑或其他方法提取總RNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：樣品總RNA 3.5 μL、5×MMLV Buffer 4.0 μL、隨機(jī)引物（10 μmol/L）1.0 μL、dNTPs （10 mmol/L） 1.0 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、MMLV酶0.5 μL，加DEPC水至20 μL，37℃反應(yīng)1 h，于-20℃保存。

利用STV檢測引物STVF （5′CGTTATCTTAGGCGTCAGCT3′），STVR （5′GGAGTTTGATTGCATCAGCG3′）[5]進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs （10 mmol/L）0.5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL，加ddH2O至25 μL。PCR參數(shù)為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，52℃復(fù)性45 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，目標(biāo)條帶為400 bp。如果需要測序驗(yàn)證，可利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接到克隆載體pMD18T，對陽性克隆測序，所得序列與GenBank中序列進(jìn)行比對。

7 開展檢測特別是番茄種子檢測，最大程度降低STV擴(kuò)散危害

鑒于STV的潛在危害以及與其他病毒高度復(fù)合侵染造成的嚴(yán)重?fù)p失，應(yīng)進(jìn)行種子檢測和針對性防控。由于種子是STV目前唯一已知的傳播途徑，因此應(yīng)加大對種子的檢測力度，對種子進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，使用經(jīng)過認(rèn)證的、經(jīng)過病毒檢測的種子，不出售、不引進(jìn)、不購買攜帶STV的種子，并對有癥狀的植株進(jìn)行早期診斷、及時(shí)清理，從根源杜絕帶毒種子在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的使用。對制種田的番茄植株進(jìn)行抽檢是必要的措施。

參考文獻(xiàn)

[1] LAEMMLEN F F， VAN MAREN A F， ENDO R M， et al. A tomato decline of unknown etiology in Imperial Valley， CA[J]. Phytopathology， 1985， 75： 1287.

[2] TURINA M， RICKER M D， LENZI R， et al. A severe disease of tomato in the Culiacan area （Sinaloa， Mexico） is caused by a new picornalike viral species [J]. Plant Disease， 2007， 91（8）： 932941.

[3] VERBEEK M， DULLEMANS A M， VAN DEN HEUVEL J F J M， et al. Identification and characterization of Tomato torrado virus， a new plant picornalike virus from tomato [J]. Archives of Virology， 2007， 152（5）： 881890.

[4] SABANADZOVIC S， GHANEMSABANADZOVIC N A， VALVERDE R A. A novel monopartite dsRNA virus from rhododendron[J]. Archives of Virology， 2010， 155：18591863.

[5] SABANADZOVIC S， VALVERDE R A， BROWN J K， et al. Southern tomato virus： The link between the families Totiviridae and Partitiviridae [J]. Virus Research， 2009， 140：130137.

[6] CANDRESSE T， MARAIS A， FAURE C. First report of Southern tomato virus on tomatoes in southwest France [J]. Plant Disease， 2013， 97： 1124.

[7] VERBEEK M， DULLEMANS A M， ESPINO A， et al. First report of Southern tomato virus in tomato in the Canary Islands， Spain [J].Journal of Plant Pathology，2015，97： 392.

[8] PADMANABHAN C， YI Zheng， LI Rugang， et al. Complete genome sequence of Southern tomato virus identified in China using nextgeneration sequencing [J/OL]. Genome Announcements， 2015， 3（5）： e0122615.

[9] PADMANABHAN C， YI Zheng， LI Rugang， et al. Complete genome sequence of Southern tomato virus naturally infecting tomatoes in Bangladesh [J/OL].Genome Announcements，2015，3（6）：e0152215.

[10]張強(qiáng)，崔百明，鄭銀英，等.新疆加工番茄上南方番茄病毒外殼蛋白基因的克隆與原核表達(dá)[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，43（4）：118122.

[11]蘇海娣，梁學(xué)超，崔百明，等.新疆加工番茄上一種類似南方番茄病毒的分子檢測[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，31（3）：271275.

[12]HALGREN A， TZANETAKIS I E， MARTIN R R.Identification， characterization， and detection of a virus associated with decline symptoms in black raspberry[J]. Phytopathology， 2007， 97（1）： 4450.

[13]MARTIN R R， ZHOU J， TZANETAKIS I E.Blueberry latent virus： an amalgam of the Partitiviridae and Totiviridae[J]. Virus Research， 2011， 155（1）： 175180.

[14]MARTIN R R， TZANETAKIS I E， SWEENEY M， et a1. A virus associated with blueberry fruit drop disease[J]. Acta Horticulture， 2006， 715： 497501.

[15]ISOGAI M， NAKAMURA T， ISHII K， et al. Histochemical detection of Blueberry latent virus in highbush blueberry plant [J]. Journal of General Plant Pathology， 2011， 77（5）： 304306.

（責(zé)任編輯：楊明麗）