滌痰湯對血管性癡呆大鼠海馬NOX2/ROS通路、GSH、HO-1表達的影響

楊超 楊佳 劉玲

(1湖北中醫藥大學2016級博士研究生，湖北 武漢 430061；2湖北省中西醫結合醫院老年病科；3華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中西醫結合科；4湖北中醫藥大學第一臨床學院 湖北省中醫院)

血管性癡呆(VD) 是指由缺血性腦卒中、出血性腦卒中和造成記憶、認知和行為等腦區低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征。流行病學調查發現〔1〕，我國65歲以上人群VD的患病率為1.1%～3.0%。滌痰湯是臨床治療癡呆的經典方劑，可有效改善VD患者的認知功能障礙，但是滌痰湯治療VD的具體作用機制尚不明確。慢性腦缺血是VD的重要病理基礎之一，由慢性腦缺血引起的氧化應激失衡在VD的發病機制中發揮重要作用。本研究通過觀察滌痰湯對VD大鼠動物行為學、海馬組織病理學及氧化應激損傷的影響，探討滌痰湯治療VD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔SPF級Wistar大鼠40只，雄性，鼠齡8～10 w，體重(200±20)g，購于湖北省疾控中心，許可證編號：SCXK(鄂) 2008-0004。飼養于室溫21～25℃、相對濕度為60%～65%、自然光照的SPF級實驗室。自由進食和飲水，適應性喂養1 w后進行實驗。

1.2藥物 滌痰湯由制天南星8 g，制半夏8 g，炒枳實6 g，茯苓6 g，橘紅5 g，石菖蒲3 g，人參3 g，竹茹2 g，甘草1.5 g，生姜5 g組成，購于湖北省中醫院中藥房，由湖北省中醫院藥劑科制備，分別濃縮成含生藥量0.971 g/ml、0.485 g/ml兩個不同濃度溶液，無菌條件裝瓶，4℃冰箱儲存備用。

1.3主要試劑 蘇木素-伊紅(HE)染色所需試劑由國家中醫藥管理局老年性癡呆(醒腦益智)重點研究室提供；RIPA裂解液(貨號G2002)、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔(貨號G23303)、HRP標記驢抗山羊(貨號G23404)、HRP標記山羊抗小鼠(貨號G23301)、HRP標記山羊抗大鼠(貨號G23302)購于武漢谷歌生物科技有限公司；活性氧(ROS，貨號：E004)、谷胱甘肽(GSH，貨號：A006-1)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4主要儀器設備 SA201 Morris水迷宮視頻分析系統(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)，DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，V300型掃描儀(EPSON)。

1.5模型制備 動物適應性喂養1 w后，采用改良的大鼠雙側頸總動脈永久性結扎法制備VD大鼠模型：大鼠術前12 h禁食，6 h禁水，給予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g) 腹腔注射麻醉，將其仰臥位固定在手術臺上，頸前部手術區域去毛，碘酒消毒，取頸前正中切口，鈍性分離右側頸總動脈，用0號手術線結扎右側頸總動脈的近心端和遠心端，用剪刀從中間剪斷，依次逐層縫合。1 w后在同樣條件下，結扎并剪斷左側頸總動脈。造模結束1 w后，進行Morris水迷宮定位航行檢測，以假手術組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，計算每只大鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比例，該值>20%判定為VD鼠。

1.6分組與給藥 將40只大鼠隨機分為假手術組、模型組、滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組，造模成功1 w后開始灌胃，給藥量均按人與大鼠體表面積系數比確定。滌痰湯高、低劑量組給藥量為滌痰湯折合生藥量9.71 g/kg、4.85 g/kg，假手術組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續4 w。

1.7觀察指標與方法

1.7.1Morris水迷宮測試 Morris水迷宮：圓形水池，周圍避光，水溫保持在24℃左右，水深約30 cm，將水池均分為4個象限，任選一象限在其中央放置一個直徑10 cm的圓形平臺，低于水面2 cm，通過安裝在水迷宮上方的攝像機追蹤大鼠位置，采集的圖像及視頻及時傳入實驗配套計算機并通過水迷宮分析系統進行數據分析。檢測時間為5 d，前4 d為定位航行測試，第5天為空間搜索實驗。定位航行測試：將各組大鼠按照1～4四個象限的順序放入水中，記錄120 s內大鼠從入水到找到平臺后四肢爬上平臺并停留超過20 s所需的時間(即逃避潛伏期)，如果大鼠在120 s內找到平臺，并停留超過20 s，記錄120 s中實際逃避潛伏期；如果在120 s內未找到平臺，由實驗者將大鼠引上平臺并停留5 s，逃避潛伏期記錄為120 s。每天4次，連續4 d，取平均值。空間搜索實驗：第5天，將平臺撤除，將大鼠由任意象限放入水中，記錄大鼠在120 s內跨越原平臺的次數及停留時間。

1.7.2海馬組織形態學觀察 Morris水迷宮結束后當天斷頭處死大鼠，冰上迅速取腦組織，留取包含完整海馬的腦段，迅速置于4%多聚甲醛(4℃，pH7.4)中固定24 h，將固定好的組織經過梯度酒精脫水，二甲苯透明后，用石蠟包埋，制作成厚度約4 μm的切片，再經過脫蠟、梯度酒精脫水、HE染色后觀察海馬組織學改變。

1.7.3免疫組化法檢測還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)2蛋白表達 將上述各組石蠟切片用SP法進行免疫組織化學染色，其方法嚴格按照試劑盒說明進行。組織中棕黃色或棕褐色顆粒為目標蛋白。在光學顯微鏡下，每張片子隨機選取 5 個視野，采用 Leica Qwin 圖像分析系統分析目標蛋白NOX2的表達情況。

1.7.4Western印跡法檢測海馬組織中血紅素氧合酶(HO)-1蛋白表達 每組稱取100 mg海馬組織，盡量剪碎，置于勻漿器中，加入1 ml RIPA冰上徹底勻漿，轉移離心管振蕩，冰浴30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清，二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度，進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉膜后，室溫下將膜于脫色搖床上用5%的脫脂牛奶，封閉2 h。封閉液稀釋一抗，4℃孵育過夜。次日，在室溫下脫色搖床上用TBST洗膜3次，每次5 min。之后加入1∶3 000稀釋二抗，室溫下孵育30 min后，用TBST洗膜3次，每次5 min。電化學發光(ECL)顯影、定影及曝光后，Alpha軟件處理系統對目標帶經行分析。

1.7.5海馬組織ROS、GSH含量檢測 準確稱取海馬組織1 g，按1∶9(海馬組織重量：生理鹽水體積=1∶9)的比例加入9倍體積的冰生理鹽水，充分研磨制備海馬組織勻漿。4℃，2 500 r/min離心10 min，吸取上清液，即為海馬組織勻漿。嚴格按照試劑盒操作說明測定ROS、GSH含量。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠空間學習記憶能力的比較

2.1.1定位航行實驗結果 模型組與假手術組比較，逃避潛伏期明顯延長〔(39.21±4.52)vs(23.40±4.07)s，P<0.01〕；與模型組比較，滌痰湯高劑量組〔(27.33±4.15)s〕、滌痰湯低劑量組〔(33.32±5.32)s〕，逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01，P<0.05)。

2.1.2空間探索實驗結果 模型組與假手術組比較，大鼠穿越原平臺次數及停留時間明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯高、低劑量組大鼠穿越原平臺次數及停留時間明顯增加(P<0.01，P<0.05)。與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組穿越原平臺次數及停留時間明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.2海馬組織病理學觀察 假手術組海馬區神經元數量正常，形態飽滿，染色均勻，細胞邊界分明，細胞膜、核膜清楚，細胞核呈類圓形。模型組海馬區神經元數量減少，可見壞死的神經元，細胞形態不規則，染色不均勻，細胞邊界模糊，細胞膜、核膜不清晰，細胞核固縮。與模型組對比，滌痰湯高劑量組、低劑量組神經元數量增多，細胞形態較規則，染色較均勻，細胞邊界較清晰。見圖1。

表1 各組空間探索實驗結果比較

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01，3)P<0.05；與中藥高劑量組比較:4)P<0.05；下表同

圖1 各組海馬神經元形態結構(HE，×400)

2.3各組NOX2表達比較 與假手術組比較，模型組NOX2蛋白相對表達量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯高劑量組、滌痰湯低劑量組NOX2蛋白相對表達量顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組NOX2蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

2.4各組HO-1蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組HO-1蛋白相對表達量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯高劑量組、滌痰湯低劑量組HO-1蛋白相對表達量顯著增高(P<0.01，P<0.05)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組HO-1蛋白相對表達量顯著增高(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組海馬 NOX2表達灰度及HO-1蛋白表達比較

圖2 各組海馬NOX2蛋白表達比較(DAB，×400)

圖3 各組海馬HO-1蛋白的表達

2.5各組ROS、GSH含量比較 與假手術組比較，模型組海馬組織勻漿ROS含量明顯升高(P<0.01)，GSH含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯高劑量組、滌痰湯低劑量組ROS含量明顯降低(P<0.01，P<0.05)，GSH含量明顯升高(P<0.01，P<0.01)；與滌痰湯高劑量組比較，滌痰湯低劑量組ROS含量明顯升高(P<0.05)，GSH含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組海馬組織勻漿ROS、GSH含量比較

3 討 論

VD屬于中醫學“愚癡病”、“呆病”等疾病范疇，病位在腦，涉及五臟。痰濁當為VD發生認知障礙的病機中心環節，清代陳士鐸在《石室秘錄》中說：“痰勢最盛，呆氣最深”，指出痰濁盛則癡呆重?，F代學者通過認知功能評價量表對血管性認知障礙患者認知功能與中醫證候的相關性進行研究發現痰濁與認知障礙關系密切〔2～4〕。祛痰開竅是改善VD認知障礙的有效方法。而作為臨床上治療癡呆的經典名方滌痰湯，出自明代方賢所著的《奇效良方》，由制南星、姜半夏、炒枳實、茯苓、橘紅、石菖蒲、人參、竹茹、甘草、生姜等藥物組成，具有滌痰開竅、醒神定志的功效，使痰濁得化，腦竅得通，使呆病得治，可有效改善VD患者的認知功能〔5，6〕?，F代研究表明，石菖蒲揮發油通過提高腦組織超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛含量，對抗脂質氧化及自由基的損傷作用，保護腦組織，從而改善癡呆大鼠的學習記憶能力〔7〕。人參皂甙Rb1可能通過降低海馬氧化應激水平及減輕海馬神經元的凋亡改善VD大鼠認知功能障礙〔8〕。

慢性腦缺血缺氧是VD的重要病理學基礎，缺血缺氧可引起腦組織氧化應激反應，損傷大腦神經元導致認知功能下降〔9，10〕。NOX2與神經元的發育、活化、增殖、凋亡等過程密切相關。當NOX2過度激活，產生的過多ROS可能損傷自身或鄰近的神經細胞〔11，12〕。抑制NOX2的激活，減少ROS產生，可改善小鼠空間學習記憶能力〔9，13〕。

HO-1是機體重要的抗氧化應激酶之一，受核因子E2相關因子2/抗氧化反應元件通路調節，在海馬神經元中高表達〔14〕。當大腦處于氧化應激狀態下，HO-1裂解血紅素產生Fe2+、膽綠素、一氧化碳，膽綠素進一步轉化為膽紅素，這些代謝產物可發揮穩定細胞膜、抗氧化等作用，從而保護神經元〔15〕。通過上調HO-1的表達能改善氧化損傷從而發揮其神經保護作用〔16〕。GSH是廣泛存在于機體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑之一，在GSH過氧化物酶的催化作用下，GSH與有毒的過氧化物發生還原反應，減輕過氧化物對細胞膜的損傷。

本研究結果提示，滌痰湯可能通過調節VD大鼠海馬組織的氧化應激失衡，從而改善大鼠認知功能障礙。其機制可能與滌痰湯降低NOX2、ROS的表達，提高HO-1、GSH的表達，恢復氧化應激平衡有關。由于VD的發病機制復雜，滌痰湯治療VD的詳細機制有待深入研究。