程氏蠲痹湯對類風濕關節炎SD大鼠血清白細胞介素-17和-35水平的影響

雷長國 覃建鋒 梁子聰 王恒 余躍生 蔡林

(1黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558013；2川北醫學院附屬醫院中醫科)

程氏蠲痹湯是清代名醫程鐘齡創制的經典方，常用于治療類風濕關節炎一類痹證，臨床療效顯著〔1〕，本研究在許霞等〔2～4〕研究基礎上，進一步探求該方發揮臨床療效的內在機制，為臨床精準用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康成年SD大鼠，均為雄性，體質量(220±15)g，購自重慶騰鑫生物技術有限公司，許可證號SCXK(渝)2017-007(SPF級)。提前1 w購入大鼠，動物房適應性飼養，飼養溫度(19±2)℃，相對濕度30%～35%，動物房系高清潔級，通風良好、自然光照，符合《實驗動物環境及設施》要求。

1.2實驗藥品、試劑及儀器 程氏蠲痹湯組方為羌活3 g、獨活3 g、秦艽3 g、桂心1.5 g、當歸9 g、川芎2.1 g、桑枝9 g、海風藤6 g、木香2.4 g、乳香2.4 g、炙甘草1.5 g，常規煎煮制備后濃縮，濃度調整為0.3 g生藥/ml,濾過除菌，-4℃冷藏備用，由黔南民族醫學高等專科學校第二附屬醫院中藥房制劑室提供。雷公藤多苷片10 mg×50片(批號：20170302)，由湖南千金協力藥業有限公司提供。完全弗氏佐劑10 ml/支(批號：201711)，購自貴州鼎國生物技術有限責任公司。大鼠白細胞介素(IL)-17、IL-35酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號分別為201711、201712)，均由南京建成生物工程研究所提供。全自動酶標儀(系列號：WH-37104623，邁瑞公司)。電子天平(規格：KHL-520 g/0.1 g,北京朗科興業稱重設備有限公司)。

1.3模型制作 除正常組注射等量生理鹽水外，其余大鼠左后足底常規消毒后，足跖皮內注射完全弗氏佐劑每只100 μl，并每日數次對大鼠四肢吹涼風、泡冷水，1 w后于大鼠尾根部皮內注射完全弗氏佐劑每只100 μl以加強，繼續對大鼠四肢吹涼風、泡冷水，再1 w后對側腳關節腫脹、功能受限，免疫應答形成，建立類風濕關節炎動物模型。

1.4分組處理 除正常組外，其余隨機分為模型組、程氏蠲痹湯高劑量組、低劑量組、雷公藤多苷片組，每組8只，共5組。正常組及模型組均用普通飼料喂養，3個治療組分別在用普通飼料喂養前以相應藥物灌服治療，程氏蠲痹湯高劑量組以7.10 g/kg灌服、1次/d,程氏蠲痹湯低劑量組以1.78 g/kg灌服、1次/d，雷公藤多苷片組以6 mg/kg灌服、1次/d，連續喂養、用藥3 w。

1.5標本留取 各組分別于第1、2、3周末灌服藥物后2 h切開股動脈取血5 ml/只，5℃以下靜置6 h,取上清液封裝置于冷凍箱-40℃待測；取血同時留取各組肝、腎、脾、四肢關節以4%甲醛液固定待病檢。

1.6指標檢測 IL-17和IL-35均采用ELISA雙抗體夾心法，嚴格按照試劑盒要求測定。將各固定組織進行脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋、切片、貼片、染色、封片，用顯微鏡觀察。

1.7統計方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析，均數多重比較在滿足方差齊性時采用LSD法及Duncan法，相關性采用Pearson相關系數分析。

2 結 果

2.1各組血清IL-35含量變化 治療第7天，與正常組比較，模型組IL-35含量顯著降低(P<0.01)，3個治療組與模型組比較差異不明顯(P>0.05)；治療第14天，程氏蠲痹湯高劑量組與雷公藤多苷片組差異明顯(P<0.05),程氏蠲痹湯高劑量組與正常組無明顯差異(P>0.05)，雷公藤多苷片組與正常組仍差異明顯(P<0.05)，程氏蠲痹湯低劑量組與模型組無明顯差異(P>0.05)；治療第21天，程氏蠲痹湯高劑量組、雷公藤多苷片組、正常組兩兩比較無明顯差異(P>0.05)，程氏蠲痹湯低劑量組與模型組差異不明顯(P>0.05)。見表1。

2.2各組血清中IL-17含量變化 治療第7天，模型組IL-17含量比正常組明顯增多(P<0.01)，3個治療組與模型組無顯著差異(P>0.05)；治療第14天，程氏蠲痹湯高劑量組、雷公藤多苷片組比模型組明顯降低(P<0.05),程氏蠲痹湯高劑量組與正常組差別不明顯(P>0.05),雷公藤多苷片組比正常組仍明顯偏高(P<0.05)；治療第21天，程氏蠲痹湯高劑量組、雷公藤多苷片組與正常組均無明顯差異(P>0.05)，程氏蠲痹湯低劑量組與模型組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組治療后各時間點血清IL-35、IL-17含量

與正常組比較：1)P<0.05；與雷公藤多苷片組比較：2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05

2.3程氏蠲痹湯高劑量組檢測指標的相關性 IL-35、IL-17含量隨治療時間推移呈負相關(r=-0.756，P=0.019)。

2.4各組踝關節病檢結果 模型組踝關節滑膜組織增生、水腫，血管翳形成，滑膜組織內小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞，慢性炎細胞浸潤為主，伴大量肉芽腫形成。正常組踝關節滑膜組織光滑，滑膜細胞單層排列，無組織水平、增生，無炎癥細胞浸潤。見圖1。程氏蠲痹湯低劑量組滑膜組織增生、水腫，血管翳形成，滑膜組織內小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞，慢性炎細胞浸潤為主，伴大量肉芽腫形成；與模型組無明顯差異。程氏蠲痹湯高劑量組滑膜組織增生、水腫情況有所減輕，可見滑膜組織內小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞，慢性炎細胞浸潤為主，肉芽腫有所減少；與雷公藤多苷片組治療第7天無明顯差異。治療第14、21天周圍炎癥細胞減少，肉芽腫數量減少。雷公藤多苷片組治療第7天滑膜組織增生、水腫情況減輕，但仍見滑膜組織內小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞，慢性炎細胞浸潤為主，肉芽腫減少；治療第14天滑膜組織內小血管增生、擴張充血情況減輕，炎癥細胞減少；治療第21天炎癥細胞減少，肉芽腫數量減少。見圖2，圖3。5組肝腎病檢無差異，說明用程氏蠲痹湯和雷公藤多苷片在較短時間內治療無肝腎毒性，較安全。

圖1 模型組與正常組踝關節病理(HE，×100)

治療第7天

治療第14天

治療第21天

治療第7天程氏蠲痹湯低劑量組

治療第4天程氏蠲痹湯低劑量組

治療第21天程氏蠲痹湯低劑量組

治療第7天雷公藤多苷片組

治療第14天雷公藤多苷片組

治療第21天雷公藤多苷片組

3 討 論

IL-17和IL-35是近年發現的細胞因子家族中的新成員，IL-17是Th17細胞主要效應因子，IL-17是T細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因子，可以通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應，Th17細胞產生的IL-17能有效地介導中性粒細胞動員的興奮過程，從而有效介導組織的炎癥反應，IL-17是一種強有力的促炎因子，而IL-35能明顯抑制Th17細胞分化和IL-17合成〔5〕，IL-35能降低IL-17水平，IL-35已成為類風濕關節炎治療新靶點〔6〕。

類風濕關節炎大鼠血清中細胞因子IL-35水平明顯減少，而IL-17表達明顯增多，提示在大鼠關節炎形成中IL-17是重要的致炎因子〔7～10〕，IL-35的抑炎作用明顯減弱〔11，12〕，本研究以程氏蠲痹湯的配伍比例，適當增大劑量，療效是確切的，甚至比常用藥雷公藤多苷片更快達到最佳療效。提示在臨床中，程氏蠲痹湯用藥須持續至2 w以上并適當保持，而雷公藤多苷片用藥須持續3 w以上并適當保持。

本實驗周期較短。臨床中為進一步減輕癥狀、鞏固療效，用藥常會適當持續，為降低機體的藥物耐受性及可能的藥物副作用，可將程氏蠲痹湯、雷公藤多苷片或其他已證明對治療類風濕關節炎可靠的藥物交替使用。

程氏蠲痹湯方中的獨活、羌活、秦艽、海風藤祛風散寒除濕，木香、桂心、桑枝疏通經絡，再佐以乳香、川芎、當歸活血化瘀，共用能祛散外邪、疏通筋脈、復行氣血，自然對風寒濕痹證有良效。

本研究對類風濕關節炎用藥的時間節點和劑量的精準把握方面作了一定的探求，為中醫經典方劑發掘利用及內在機制闡明提供一定參考。

本研究存在實驗周期短、樣本較少、檢測指標較少及模型制作與臨床患者實際致病存在差異等諸多局限，以后的研究中應增大樣本數、模擬臨床的病患周期、考察更多的可能干擾因素，把經典方程氏蠲痹湯的臨床及實驗研究引向深入。