橙皮苷對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用及機制

陳彤 班遵浦 羅國鴻 袁立英 廖效竹

(遵義市第一人民醫院腎內科，貴州 遵義 563000)

腎臟缺血再灌注(I/R)損傷是引起急性腎損傷(AKI)的主要原因，常繼發于腎臟移植、腎臟腫瘤切除術、腎動脈血運重建術等，與術后短期、長期生存率負相關〔1～4〕。橙皮苷(Hesp)具有抗凋亡、抗氧化應激等多重藥理學功效，從而在腫瘤發生、缺血性神經元損傷、糖尿病心肌I/R損傷等多種病理過程中發揮保護功能〔5～7〕。研究證實，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)依賴性信號通路激活是Hesp發揮多種保護功能的關鍵分子機制〔8，9〕。然而，Hesp是否通過調控PI3K/AKT通路在腎臟I/R中發揮保護功能尚未闡明。本研究建立大鼠腎臟I/R損傷模型，擬觀察Hesp對I/R腎臟的影響及其可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物：SD雄性大鼠(180～200 g，SPF級)由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。試劑與儀器：Hesp(純度>98%)與羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)均購自國藥集團化學試劑有限公司；PI3K/AKT通路抑制劑(LY294002)購自美國Sigma公司；RNA引物、提取、反轉錄與擴增試劑盒購于TaKaRa公司；Bax、Bcl-2、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)-3/9抗體購于Abcam公司；磷酸化(p)-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于Santa Cruz生物技術公司；超氧化物歧化酶(SOD)/丙二醛(MDA)分析試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒與電化學發光(ECL)試劑盒購自武漢碧云天生物技術研究所；TUNEL凋亡試劑盒購置Roche公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗由武漢三鷹生物技術提供。

1.2腎臟I/R損傷模型構建 參考文獻〔10〕方法構建大鼠腎臟I/R損傷模型。1% 戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹正中切口后逐層分離腹膜暴露腎臟。鈍性分離右側輸尿管并用5-0絲線結扎，結扎右側腎蒂后取下右腎，腹腔內補充肝素(40 μl)抗凝。分離左側腎臟后動脈夾夾閉左側腎蒂誘導腎臟缺血，腎臟由鮮紅色轉為紫黑色代表缺血成功。缺血45 min后，松開動脈夾以恢復血流供應，腎臟由紫黑色轉為鮮紅色代表再灌注成功。再灌注24 h后，留取血液和腎臟標本進行下一步檢測。假手術(SO)組大鼠除左側腎蒂不夾閉外，其他處理方法同腎臟I/R(I/R)組。

1.3實驗分組 SD大鼠隨機分為3組(n=6)：SO組、I/R組和腎臟I/R+Hesp處理(I/R+Hesp)組。I/R+Hesp組在腎臟I/R術前連續3 d給予Hesp(200 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na溶液)灌胃處理〔8〕；SO組與I/R組大鼠給予同等劑量0.5% CMC-Na。根據分組情況按上述方法構建腎臟I/R損傷模型。實驗處理完成后，留取血液和腎臟組織標本進行病理及分子生物學檢測等。為進一步探討Hesp抑制腎臟I/R損傷的具體分子機制，給予LY294002(0.3 mg/kg)進行干預。SD大鼠隨機分為4組(n=6)：I/R組；I/R+Hesp組；I/R+LY294002組；I/R+Hesp+LY294002組。根據分組情況，按上述方法給予Hesp預處理；I/R術前30 min 給予LY294002尾靜脈注射。

1.4血清肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)含量測定 參考文獻〔1，2〕方法檢測腎臟I/R損傷血清Cr與BUN含量。收集1 ml 血液標本，室溫靜置2 h后4℃離心10 min (3 500 r/min)。收取上清液后全自動生化檢測儀(Dimension RXL Max，Siemens，Germany)檢測Cr與BUN含量。

1.5蘇木素-伊紅(HE)與TUNEL染色 參考文獻〔4〕方法，各組大鼠I/R左腎組織石蠟切片(厚度4 μm)，行常規HE染色，隨機選取10個視野沿皮質到髓質方向在光學顯微鏡觀察并拍片(400倍)，并根據腎小管上皮腫脹、間質水腫、小管間出血等損傷程度進行評分(0～4分)：0分，損傷范圍<10%；1分，損傷范圍10%～25%；2分，損傷范圍26%～50%；3分，損傷范圍51%～75%；4分，損傷范圍>75%。此外，TUNEL染色按試劑盒操作說明進行，胞核黃染為陽性著色，凋亡指數=(陽性細胞數/總細胞數)×100%。

1.6MDA含量與SOD活性測定 參考文獻〔1～3〕方法檢測MDA含量及SOD酶活性。新鮮留取的腎臟標本勻漿、4℃離心10 min(3 500 r/min)后，收集上清液分別采用硫代巴比妥法(TBA)測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，分別在450 nm、530 nm波長處測定吸光度，計算SOD活性及MDA含量。

1.7Western印跡檢測 參考文獻〔1～4〕方法檢測相關蛋白表達情況。取-80℃保存的腎臟組織，提取總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，然后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，用Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3/9、p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT及GAPDH一抗4℃孵育過夜，二抗室溫繼續孵育1 h。ECL試劑盒顯色，Image Lab軟件分析目的條帶與內參條帶灰度值。

1.8統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1Hesp改善I/R誘導的腎臟損傷 與SO組相比，I/R組Cr與BUN含量顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Hesp組Cr、BUN水平明顯降低(P<0.05)。HE染色顯示I/R組腎小管上皮細胞壞死分離、基底膜暴露、間質充血及炎癥細胞浸潤，且與SO組比較病理損傷評分明顯升高(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組Cr、BUN及腎小管損傷評分比較

與SO組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05；表2、3同

2.2Hesp抑制I/R誘導的凋亡與氧化應激反應 與SO組相比，I/R組Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表達顯著升高，Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著上調(P<0.05)，SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+Hesp組Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，凋亡率顯著降低，SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表2、表3、圖2、圖3。

2.3Hesp在腎臟I/R損傷中激活PI3K/AKT信號通路 與SO組相比，I/R組p-PI3K與p-AKT表達明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Hesp組p-PI3K、p-AKT蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表3、圖4。

2.4LY294002逆轉Hesp對I/R腎臟的保護作用 與I/R組比較，I/R+Hesp組Cr、BUN蛋白表達及腎小管損傷評分均顯著降低(P<0.05)。與I/R+Hesp組相比，I/R+Hesp+LY294002組血清Cr、BUN含量均明顯升高并伴隨腎小管損傷評分顯著升高(P<0.05)。I/R+LY294002組與I/R+Hesp+LY294002組Cr、BUN含量及腎小管損傷評分差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表2 各組凋亡相關蛋白表達比較

表3 各組p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達及凋亡率比較

圖2 各組TUNEL染色圖(×400)

圖3 Western印跡檢測Bax、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表達

圖4 Western印跡檢測p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達

組別Cr(μmol/L)BUN(mmol/L)腎小管損傷評分(分)I/R組141.2±4.219.2±0.93.13±0.1I/R+Hesp組82.3±2.61)11.3±0.81)1.35±0.211)I/R+ LY294002組139.2±5.32)19.7±0.72)3.16±0.422)I/R+ Hesp +LY294002組140.1±5.12)19.8±1.92)3.13±0.052)

與I/R組相比：1)P<0.05；與I/R+Hesp組相比：2)P<0.05

3 討 論

本研究結果表明，Hesp能夠顯著抑制I/R誘導的腎臟功能障礙及病理損傷，并在凋亡、氧化應激關鍵病理生理環節發揮作用。Hesp促進I/R腎臟PI3K/AKT信號通路激活，而抑制PI3K/AKT可逆轉Hesp的腎臟保護功能。以上結果表明，Hesp主要通過PI3K/AKT依賴性途徑在腎臟I/R凋亡與氧化應激關鍵致病環節發揮保護功能。

近年來，Hesp在I/R損傷中的保護作用日益得到關注，針對其有效干預時間探討也持續進展〔5～7〕。Gandhi等〔11〕在心肌I/R損傷中研究發現：Hesp預處理(15 d)能夠顯著降低心肌梗死面積。在Hesp對糖尿病心肌I/R損傷的干預實驗中觀察到，連續2 w Hesp預處理可以減輕糖尿病心臟I/R損傷，減小心肌梗死面積〔6〕。Li等〔8〕進一步觀察了短期(3 d)Hesp預處理對心肌I/R損傷的影響，發現其能夠改善心臟病理損傷，抑制炎癥、凋亡與氧化應激等多重致病環節。然而，Hesp對腎臟I/R損傷是否有保護功能尚無相關研究佐證。與以上研究結果一致，本研究在腎臟I/R損傷中觀察到Hesp(3 d)預處理對腎臟功能、結構及凋亡、氧化應激反應具有明顯的干預作用。因此，結合既往研究證據，短期或長期Hesp處理對I/R損傷具有顯著療效，同時本研究也進一步拓展了Hesp的藥理學功效，為臨床防治腎臟I/R損傷提供了理論依據和有效的策略。

腎臟I/R損傷的發生機制復雜，凋亡級聯及氧化反應過度激活是其主要病理生理改變。其中，前者以促凋亡分子Bax、凋亡執行蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3上調并伴隨抗凋亡分子Bcl-2表達下調為主要表現，而氧化應激反應中抗氧化應激酶SOD活性降低并伴隨氧化應激代謝產物MDA含量上調〔1～4〕。既往研究表明，PI3K/AKT信號通路激活是腎臟I/R損傷中的關鍵內源性保護機制，其主要通過影響下游多重效應分子〔如血紅素氧合酶(HO)-1、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、轉錄因子NF-E2相關因子(Nrf)2等〕調控凋亡、氧化應激等主要病理損傷過程〔10，12〕。Liu等〔2〕研究發現，Kappa型阿片受體(KOR)介導的PI3K/AKT/eNOS激活能夠有效減輕I/R誘導的凋亡與氧化應激反應，且其腎臟保護功能可以被PI3K/AKT抑制劑顯著逆轉。Zhang等〔12〕在腎臟I/R損傷中證實，Tempol 誘導PI3K/AKT/Nrf2信號通路激活能夠抑制cleaved caspase-3表達，并調控SOD/MDA改變，從而減輕凋亡與氧化應激反應的發生。以上結果表明，選擇性干預PI3K/AKT依賴性途徑是防治腎臟I/R的有效途徑。值得注意的是，Hesp具有激活PI3K/AKT通路的藥理活性，并構成抑制I/R或缺氧復氧損傷的主要分子機制〔9〕。基于以上研究結果，本研究猜測Hesp也可能通過PI3K/AKT依賴性途徑在腎臟I/R中發揮保護功能。本研究結果表明，I/R誘導p-PI3K/AKT激活在Hesp干預后進一步上調，并伴隨凋亡與氧化應激反應的下調；而特異性抑制PI3K/AKT通路后，Hesp的腎臟保護功能被明顯抑制。既往研究聯合本實驗證據為Hesp減輕腎臟I/R損傷增加了新的理論依據和潛在干預靶點，通過Hesp途徑靶向調控PI3K/AKT可能為防治腎臟I/R損傷提供有效途徑。此外，鑒于Hesp在調控多種信號通路〔如 Janus激酶(JAK)2/轉錄激活因子(STAT)3、Wnt/β-catenin通路等〕中的藥理學活性〔13，14〕，其腎臟I/R抑制功能是否依賴性于其他分子機制仍需進一步研究。