HPV16/18 DNA在原發(fā)性胃癌患者腫瘤組織中的表達(dá)及意義

郭丹，郭建巍

1北京市海淀醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100080

2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京1000480

胃癌的發(fā)生不僅與多種癌基因激活、染色體雜合缺失、抑癌基因失活等有關(guān)，還與吸煙、鹽分過(guò)度攝入、長(zhǎng)期攝入含有亞硝胺的食品及飲用水、微生物感染等有關(guān)，其中微生物感染包括幽門螺桿菌、人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）等相關(guān)病毒感染[1]。HPV是一類無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)8 kb。HPV病毒常通過(guò)感染皮膚、黏膜上皮組織等，引起皮膚疣、肛門生殖器疣、喉乳頭狀瘤、肛門生殖器上皮內(nèi)瘤等疾病[2]。已有研究表明，高危型HPV16/18的持續(xù)感染及多重感染不僅是導(dǎo)致宮頸癌變的主要原因，而且還與其他多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。但是，目前中國(guó)關(guān)于高危型HPV16/18感染與胃癌關(guān)系的研究尚少。因此，本研究對(duì)HPV16/18 DNA在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與胃癌患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年6月至2013年5月北京市海淀醫(yī)院收治的行手術(shù)切除的原發(fā)性胃癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃腺癌；②符合衛(wèi)生部制定的《胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 316-2010）》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③術(shù)前未接受與身體耐受相關(guān)的藥物化療；④未合并其他惡性腫瘤；⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病例診斷標(biāo)準(zhǔn)不明確；②重復(fù)報(bào)告或資料雷同、質(zhì)量較差等。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入胃癌患者72例。其中，男48例，女24例；年齡39～78歲，平均（65.20±9.27）歲；賁門癌36例，胃體癌30例，胃竇癌6例；Lauren分型[7]：彌漫型37例，腸型27例，混合型8例；臨床分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期31例，Ⅲ期13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例；有吸煙史33例；有飲酒史29例；有胃癌家族史4例。收集72例胃癌患者的胃癌組織標(biāo)本。

1.2 HPV16/18 DNA檢測(cè)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

取胃癌組織標(biāo)本25 mg，在液氮中速凍后采用液氮預(yù)冷的研缽研磨組織至粉末狀，隨后轉(zhuǎn)移至1.5 ml的離心管中。采用通用型柱式基因組提取試劑盒（購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。收集的DNA溶液于-20℃保存，用作聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）模板。采用熒光定量PCR檢測(cè)收集的DNA溶液中HPV16/18 DNA，HPV16/18試劑購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安生物技術(shù)有限公司。采用AXYGEN 8聯(lián)排PCR管，依次加入反應(yīng)液 40 μl，Taq 酶 3 μl，核酸模板 2 μl，振蕩均勻后瞬時(shí)離心15 s。PCR反應(yīng)條件為93℃2 min；93℃ 45s，55℃ 60s，10個(gè)循環(huán)；93℃ 30 s，55℃45s，40個(gè)循環(huán)；收集熒光。判定標(biāo)準(zhǔn)以核酸檢測(cè)水平大于1000 copy/ml為陽(yáng)性。

1.3 資料收集

收集患者的性別、年齡、體重、吸煙習(xí)慣、飲酒等基本信息，以及臨床信息，如腫瘤直徑、解剖部位、分化程度、分期、轉(zhuǎn)移情況等。分析HPV16/18 DNA表達(dá)與胃癌患者臨床特征的關(guān)系。所有患者均至少電話隨訪5年，統(tǒng)計(jì)所有患者的生存情況，并分析HPV16/18 DNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Logrank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16/18 DNA表達(dá)情況

72例原發(fā)性胃癌患者中，HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)41例（56.94%），陰性表達(dá)31例（43.06%）。

2.2 HPV16/18 DNA表達(dá)與胃癌患者臨床特征的關(guān)系

不同Lauren分型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胃癌患者胃癌組織中HPV16/18 DNA的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，Lauren分型為彌漫型和腸型、TNM分期為Ⅲ期和Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者胃癌組織中HPV16/18 DNA的陽(yáng)性表達(dá)率較高。而不同性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、解剖位置胃癌患者胃癌組織中HPV16/18 DNA的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)情況的比較（ n=72）

2.3 HPV16/18 DNA表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)胃癌患者的5年累積生存率為58.54%，低于HPV16/18 DNA陰性表達(dá)胃癌患者的74.19%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.909，P=0.167）。（圖1）

圖1 HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)（ n=41）和HPV16/18 DNA陰性表達(dá)（ n=31）胃癌患者的生存曲線

3 討論

臨床中，超過(guò)60%的胃癌患者確診時(shí)已為晚期，錯(cuò)過(guò)了根治性切除手術(shù)的治療時(shí)機(jī)。由于胃癌的發(fā)生、發(fā)展受多種因素調(diào)控，因此尋找可以直接影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為的關(guān)鍵因素并加以干擾，對(duì)改善胃癌患者的治療效果及預(yù)后意義重大。HPV是宮頸癌的主要致病因子，99%的宮頸癌患者宮頸癌組織中可以檢測(cè)出HPV，尤其是高危型HPV16/18的陽(yáng)性檢出率更高[8-9]。此外，HPV16/18 DNA在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤、肺癌等腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)也逐漸引起臨床的廣泛關(guān)注[10-11]。但目前中國(guó)關(guān)于HPV16/18 DNA對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響報(bào)道尚少，董衛(wèi)國(guó)等[12]提出了高危型HPV16型感染可能與胃癌發(fā)生有關(guān)的觀點(diǎn)。Ding等[13]研究顯示，HPV16型感染為食管癌、胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。Zeng等[14]進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃分析納入了1917例胃癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28%的胃癌患者合并HPV感染，因而認(rèn)為HPV感染可增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Fakhraei等[15]采集了100例胃癌患者的手術(shù)標(biāo)本，采用PCR擴(kuò)增檢測(cè)了胃癌組織中HPV DNA的表達(dá)情況，并分析HPV DNA表達(dá)與胃癌患者吸煙習(xí)慣、飲酒量、體重、胃癌家族史、解剖部位、病理診斷情況的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV DNA的陽(yáng)性表達(dá)率為40%，并認(rèn)為HPV感染是胃癌發(fā)生的高危因素。

為進(jìn)一步明確HPV DNA與胃癌發(fā)生的關(guān)系，本研究選取經(jīng)手術(shù)切除、病理確診的原發(fā)性胃癌患者的胃癌組織標(biāo)本72例，采用熒光定量PCR檢測(cè)所有組織標(biāo)本中HPV16/18 DNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示HPV16/18 DNA的陽(yáng)性表達(dá)率為56.94%，提示原發(fā)性胃癌患者胃癌組織中HPV16/18 DNA的陽(yáng)性表達(dá)率較高，與相關(guān)報(bào)道具有一致性[12-15]，推測(cè)其原因?yàn)槊谀蛏车赖腍PV可能上行感染進(jìn)入結(jié)腸、胃，繼而引起胃部感染或病變；或HPV通過(guò)口腔，下行感染至食管，再到胃。已有研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染與口腔癌、肛門癌、食管癌、結(jié)直腸癌等的發(fā)生有關(guān)，而且口腔癌和肛門癌中HPV的感染率可高達(dá)58%、80%[16-19]。還有研究從基因角度分析了HPV與胃癌的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV感染與p53基因的表達(dá)具有相關(guān)性，而作為一種腫瘤抑制基因，p53基因的突變促進(jìn)了人上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[20]。王佐君等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌發(fā)生過(guò)程中，HPV16感染與幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A的表達(dá)呈正相關(guān)，故認(rèn)為HPV與幽門螺桿菌導(dǎo)致的惡性病變具有密切關(guān)系。由此可見(jiàn)，胃部HPV感染可能最初由口腔、肛門、結(jié)腸引起，并逐漸由前體病變轉(zhuǎn)化為惡性病變，在此過(guò)程中，可能受到相關(guān)基因調(diào)控或幽門螺桿菌感染的影響，最終導(dǎo)致癌變組織中HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入分析。同時(shí)，本研究分析了HPV16/18 DNA表達(dá)與原發(fā)性胃癌患者臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同Lauren分型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胃癌患者胃癌組織中HPV16/18 DNA的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，Lauren分型為彌漫型和腸型、TNM分期為Ⅲ期和Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者胃癌組織中HPV16/18 DNA的陽(yáng)性表達(dá)率較高。Lauren分型中，腸型胃癌以高分化、中分化腺體為主，彌散型則由散在于胃壁、無(wú)或只有少量腺體形成的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，通常侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生漿膜侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此預(yù)后更差[22]；TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況則可直接反映患者的預(yù)后，由此可見(jiàn)，HPV16/18 DNA表達(dá)與Lauren分型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并可能影響患者的預(yù)后。本研究結(jié)果還顯示，HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)胃癌患者的5年生存率低于HPV16/18 DNA陰性表達(dá)胃癌患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能與本研究樣本量少及患者病情情況有關(guān)。綜上所述，HPV16/18 DNA的檢測(cè)有助于評(píng)估原發(fā)性胃癌患者的病情，并指導(dǎo)輔助治療，其預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。