嗜熱擬青霉糖化酶的性質及其在黃酒釀造中的應用

劉雙平，謝雅茜，江正強，閆巧娟，毛 健，4

（1.江南大學食品學院糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫 214122；2.中國農業大學工學院，北京100083；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；4.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興 312000）

黃酒是世界三大古酒之一，經過制曲、浸米、蒸 煮、前酵、后酵、壓榨、澄清、煎酒、陳化、勾兌等生產工藝釀造而成，黃酒除飲用外，也可用作食醋釀造的原料。傳統黃酒制作過程中通過加入麥曲形成復雜的微生物群落結構和多酶復合體系（α-淀粉酶[1]、糖化酶[2]、普魯蘭酶[3]、蛋白酶[4]、纖維素酶[5]、脂肪酶[6-7]），從而降解原料中的蛋白質、淀粉、脂肪、粗纖維等成分為細胞所利用，但是由于麥曲質量不穩定、發酵控制不系統等因素會導致黃酒發酵速率緩慢，從而會影響出酒率及黃酒的品質，甚至出現酸敗現象。

隨著釀酒科學技術的進步，科研人員對黃酒釀造過程的深入研究，黃酒釀造工藝得到大幅改進，特別是酶制劑在黃酒生產中的應用，使得黃酒的品質得到大幅提升[8-9]。而糖化酶在黃酒生產中的應用則恰好彌補了傳統工藝中的不足之處，解決了麥曲中酶系和微生物產糖化酶活力不足的問題。在減少麥曲用量的同時，使原料的糖化速率不會降低，在降低成本的同時又很好的保證了出酒率和黃酒的品質。因此，尋找新型糖化酶用于黃酒釀造具有重要價值。

糖化酶[EC 3.2.1.3]即葡萄糖淀粉酶，屬于酸性單鏈糖苷水解酶，具外切酶活性。該酶能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物非還原末端的α-1,4-糖苷鍵生成β-D-葡萄糖，同時也能緩慢水解α-1,6-葡萄糖苷鍵、少量α,β-(1,1)-、α-(1,2)-鍵和極少量α-1,3-鍵[10]，在黃酒生產中有廣泛的應用[11-12]。團隊前期研究中篩選到1株能夠產糖化酶的嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）J18，并在畢赤酵母中對該糖化酶進行了過量表達。本文將對表達得到的嗜熱擬青霉來源糖化酶（PtGA15）的酶學性質做進一步探究，并考察其在黃酒釀造中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

原料：糯米，購自超市。

糖化酶PtGA15：嗜熱擬青霉（P.thermophila）J18來源，畢赤酵母表達；分子量67 kDa，比酶活148.5 U/mg。

麥曲：上海金楓酒業股份有限公司。

活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

α-淀粉酶：樟絨枝霉來源，畢赤酵母表達，實驗室分離純化保存；酶活11895 U/g，最適pH 6.5，最適溫度65℃，50℃以下能保持90%以上酶活力，pH5～10內穩定。

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器和設備

TU-1800PC紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器設備有限責任公司；HZQ-F-160全溫振蕩培養箱，江蘇太倉實驗設備廠；LRH-250S恒溫恒濕培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；HGJR-02紅外加熱爐，河南中良科學儀器有限公司；PB21型pH計，德國賽多利斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糖化酶（PtGA15）的酶學性質

酶活力測定方法：取13 g/L可溶性淀粉溶液（以10 mM pH 6.0的醋酸緩沖液為溶劑）0.l mL，70℃預熱5 min，加入0.l mL酶液，70℃反應20 min，加入1.0 mL DNS試劑，沸水浴反應15 min，速冷，在540 nm波長下測定吸光值，0.l mL蒸餾水代替酶液做對照。酶活力定義：以1 min催化底物生成l μmol的葡萄糖所需酶量定義為一個酶活單位。

1.3.1.1 最適pH值及其穩定性

最適pH值測定：在70℃條件下，以pH值及不同體系的緩沖液（Citrate，pH3.0～6.0；Mcilvaine，pH3.0～7.0；Acetate，pH4.0～6.0；Phosphate，pH6.0～8.0；HEPES，pH7.0～8.0；Tricine，pH7.5～8.5；CHES，pH8.5～10.0）配制底物13 g/L可溶性淀粉溶液，按照標準酶活力方法測定酶活力，以酶活力最高點作為100%。

pH值穩定性：以不同pH值及不同體系的緩沖液將純酶稀釋適當倍數，40℃保溫30 min，冰水浴冷卻30 min后于最適pH值條件下測定酶活力，以未處理的酶液作為對照，計算殘余酶活占對照的百分含量。

1.3.1.2 最適溫度及熱穩定性

最適溫度測定：用50 mM pH 5.0 Citrate緩沖液配制底物，分別在不同溫度（50～80℃）下與底物反應，按照標準方法測定糖化酶的酶活力，以酶活力最高點為100%。

熱穩定性：純酶用最適pH值體系適當稀釋后于45～80℃保溫30 min，冰水浴冷卻30 min，采用標準方法測定酶活力，以未處理的酶液作為對照，計算殘余酶活占對照的百分含量。

1.3.1.3 金屬離子和化合物對酶活的影響

糖化酶于50 mM pH 5.0的Citrate緩沖液中稀釋一定倍數，分別加入不同的金屬離子，使其終濃度為1 mM，將酶液在25℃下保溫30 min，在最適條件下測定糖化酶的殘余酶活力，以沒有添加金屬離子及化合物的酶液作為對照。

1.3.1.4 底物特異性

分別以可溶性淀粉、糯米淀粉、大米淀粉、糖原、支鏈淀粉、糊精、普魯蘭糖為底物測定其底物特異性，所有底物濃度均為1.3%（w/v），反應條件為50 mM pH5.0 Citrate緩沖液，在70℃下反應20 min后測定酶活。

1.3.1.5 水解特性

將濃度為10 mg/mL的可溶性淀粉、糯米淀粉、大米淀粉、支鏈淀粉，溶于50 mM pH 5.0 Citrate緩沖液中，酶添加量為2.0 U/mL，60℃水浴中反應1 h，在不同時間（0、20 min、40 min和60 min）取樣。TLC條件：硅膠板（60 F 254，E.Merk，德國）在正丁醇-乙醇-水系統中展層2次，在表面均勻噴灑5%硫酸甲醇溶液，吹干并在130℃顯色；以麥芽寡糖混合物為標準。

1.3.2 糖化酶（PtGA15）在黃酒中的應用

采用如圖1所示的黃酒釀造工藝進行黃酒發酵，并測定成品酒的理化指標。

圖1 糖化酶在黃酒中的應用

還原糖的測定采用DNS法[13]；酒精度、總酸、氨基態氮、pH值均按照《GB/T 13662—2008黃酒》[15]中的方法測定；干物質含量的測定采用折射儀法[14]，葡萄糖值（Dextrose Equivalent，DE）[16]的計算公式如下：

1.3.2.1 糖化時間對糖化效果的影響

糯米經液化處理后，迅速降溫至50℃，按150 U/g原料加入糖化酶PtGA15，保溫糖化，分別糖化30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210min、240min，取樣并迅速冷卻，稀釋后10000r/min離心3 min取上清液，測定上清液中還原糖含量及DE值隨時間的變化情況。

1.3.2.2 糖化階段糖化溫度的確定

糯米經液化處理，迅速降溫至50℃，按150 U/g原料加入糖化酶PtGA15，分別在50℃、55℃、60℃下保溫糖化3 h，糖化完成后迅速冷卻，10000 r/min，離心3 min取上清液，并測定上清液中還原糖含量及DE值隨溫度的變化情況。

1.3.2.3 添加量對黃酒理化指標的影響

分別按 0、50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、300 U/g、400 U/g原料的量添加糖化酶PtGA15進行黃酒釀造，于28～30℃前酵4 d，轉15℃后酵15 d，測定最終黃酒的殘糖含量、酒精度、氨基態氮、總酸等理化指標，以確定糖化酶PtGA15的最佳添加量。

2 結果與分析

2.1 糖化酶（PtGA15）的酶學性質

2.1.1 最適pH值及其穩定性

已報道的真菌來源糖化酶，多在酸性條件下保持穩定，最適pH值大多集中在4.5～6.5[17-18]，pH值穩定性范圍差別不大，與之前的研究相似，糖化酶PtGA15在pH4.5～6.5范圍內酶活較穩定。如圖2a所示，糖化酶PtGA15在pH5.0的檸檬酸緩沖液中，酶活性最高，在乙酸緩沖液中，pH5.5時酶活最高，但比在檸檬酸緩沖液中的酶活低了近10%；當pH＞6時，酶活隨著pH值的升高而迅速降低。酶液在pH4.5～6.5之間時穩定性最好，酶活穩定性依然是在檸檬酸緩沖液中最高，在磷酸緩沖液中次之，并且發現在此pH值范圍內處理30 min后，酶活力保持在80%以上（圖2b）。

圖2 糖化酶PtGA15最適pH值(a)及pH值穩定性(b)

2.1.2 最適溫度和溫度穩定性

多數真菌來源的糖化酶在65～70℃時酶活最高，在65℃以內都能維持較好的酶活力[17-19]。結果表明，糖化酶PtGA15最適反應溫度為70℃，在65～70℃范圍內表現出較高的酶活力，在70℃時能保持90%以上的酶活（圖3a、圖3b）。

2.1.3 金屬離子及化合物對酶活力的影響（表1）

在 Marlida[20]、Kumar[21]及 Li[22]等的研究中發現，糖化酶活力對Ca2+表現出依賴性。然而，研究結果表明（表1），糖化酶PtGA15對金屬離子的敏感性一般，無明顯依賴性。除Li+對酶活有很弱的抑制作用外，金屬離子對其酶活都有一定的提高，其中Ba2+提高效果最大，為127.2%，Mg2+次之，為125.3%。另外DTT、EDTA、SDS存在時，其酶活力未受到明顯影響。

圖3 糖化酶PtGA15的最適溫度(a)和溫度穩定性(b)

表1 金屬離子及部分試劑對糖化酶PtGA15酶活的影響

2.1.4 糖化酶PtGA15的底物特異性（表2）

表2 糖化酶PtGA15的底物特異性

如表2所示，糖化酶PtGA15對支鏈淀粉表現出較高的水解活性（184.8 U/mg），糯米和大米淀粉次之（169.5 U/mg），對糖原（135.7 U/mg）的水解能力比可溶性淀粉和土豆來源的糊精略低，對可溶性淀粉和糊精的水解活性無明顯差異，對普魯蘭酶的水解活性最低（43.1 U/mg）。

2.1.5 糖化酶PtGA15的水解特性分析（圖4）

糖苷水解酶對底物的水解能力主要受該酶對不同糖苷鍵水解能力高低的影響，相比其他底物，支鏈淀粉有更多的非還原末端和α-1,4-糖苷鍵，而糖化酶主要水解α-1,4-糖苷鍵[10，23]。如圖4所示，糖化酶PtGA15水解支鏈淀粉、大米淀粉、可溶性淀粉、糯米淀粉的產物通過TLC分析，發現糖化酶Pt-GA15對支鏈淀粉表現出較高的水解活性，對普魯蘭糖的水解活性最低，并且該酶水解各類淀粉的產物唯一，為葡萄糖；而且在反應一段時間后，當溶液中僅有葡萄糖的情況下，反應時間加長，沒有其他高于葡萄糖的聚合度的高分子寡糖生成，說明該酶轉糖苷能力很弱或沒有。

圖4 糖化酶PtGA15水解支鏈淀粉、大米淀粉、可溶性淀粉和糯米淀粉的TLC分析

2.2 糖化酶（PtGA15）在黃酒中的應用

2.2.1 糖化時間的優化（圖5）

圖5 糖化時間對糖化酶糖化效果的影響

由圖5可看出，當糖化酶PtGA15的添加量為150 U/g原料，糖化時間為180 min時，糖化液的DE值達到最高，為115.1%，隨后DE值出現一定的下降，另外還原糖含量在120 min后沒有明顯的增加。適量的寡糖和還原糖為酵母細胞迅速生長繁殖提供營養，綜合DE值和還原糖含量情況確定最適的糖化時間為180 min。

2.2.2 糖化溫度的優化（圖6）

由圖6可知，溫度能夠顯著影響酶促反應。糖化180 min時，當糖化溫度為50℃時，所得糖化液中還原糖含量最高，隨著糖化溫度上升，還原糖含量降低。糖化階段，糖化酶的熱穩定性對其糖化能力有明顯的影響，糖化酶PtGA15在50～60℃內，隨著溫度升高，酶的熱穩定性降低，高于60℃后迅速失活，從而影響糖化水解能力。由于還原糖含量直接影響酵母生長繁殖的速度，繼而影響發酵產酒精的能力，故確定糖化階段溫度為50℃。

圖6 糖化溫度對糖化酶糖化效果的影響

2.2.3 糖化酶（PtGA15）添加量的優化（圖7）

圖7 糖化酶PtGA15加酶量對黃酒前酵階段酒精生成的影響

不同的糖化酶PtGA15添加量對黃酒理化指標的影響的實驗結果如圖7和表3所示。發酵初期12 h內所有樣品的酒精度都已經占總的酒精產量的一半以上，而且加酶量越大，酒精度上升越快，發酵效率越高。由于液化和糖化同時進行，α-淀粉酶和糖化酶之間存在明顯的協同作用，促進還原糖含量的增加，經酵母生長繁殖及時消耗，底物抑制不明顯，酒精度含量上升速度與加酶量正相關。相比不加酶時發酵36 h后酒精度基本保持穩定，加酶的樣品只需要24 h左右。

由表3可知，釀制的黃酒各項常規理化指標達到傳統型國標《GB/T 13662—2008黃酒》的要求。結果表明加酶量越大，殘還原糖含量越低，酒精度越高；加酶量為200 U/g原料時酒精度達16.6%vol，相比不加酶時的12.7%vol，提高了30.7%，隨后酒精度增長減緩。另外，添加糖化酶PtGA15的黃酒，最終α-氨基態氮含量也較不加酶時明顯提高，150 U/g原料添加時提高最多，為32.7%。添加糖化酶PtGA15有利發酵的進行，能夠提高發酵效率，增加原料利用率。加酶量為200 U/g原料時酒精度和α-氨基態氮含量相比300 U/g、400 U/g原料不存在顯著性差異，與Devantier等[24]、Shen等[25]的研究結果相近，故確定加酶量為200 U/g原料時，發酵效果最好。

3 結論

應用糖化酶PtGA15于黃酒釀造，發現添加糖化酶PtGA15有利于發酵的進行，能夠提高發酵效率，增加原料利用率。當糖化溫度為50℃，糖化時間3 h時，糖化液中還原糖和干物質含量最高；酶添加量為200 U/g原料時，各項指標與添加量為300 U/g、400 U/g原料時不存在顯著性差異。添加糖化酶PtGA15生產的黃酒酒精度達16.6%vol，相比不加酶時的12.7%vol，提高了30.7%；與工廠樣品相比，酒精度有所上升，殘糖含量略高，pH值和總酸含量略低，但綜合來說相差不大，各項理化指標均達到國標《GB/T 13662—2008黃酒》的要求。生產中一般糖化工藝溫度控制在60～65℃，pH4.5左右，對酶的耐酸性及熱穩定性有較高的要求，而糖化酶PtGA15不僅在pH4.5時具有較好的穩定性，而且在50℃就表現出較高的酶活性，該酶應用于生產，不僅對出酒率及黃酒品質有所保證，同時還能起到節能減排的效果。

表3 糖化酶 PtGA15添加量對黃酒理化指標的影響